artigo Original
Papel imunossupressor e remodelador das células-tronco mesenquimais em um modelo experimental de doença renal crônica Immunosuppressive and remodelling properties of mesenchymal stem cells in a model of chronic kidney disease Patricia Semedo1, Matheus Corrêa Costa2, Marcos Antonio Cenedeze3, Denise Maria Avancini Costa Malheiros4, Maria Heloisa Massola Shimizu5, Antonio Carlos Seguro6, Alvaro Pacheco-Silva7, Niels Olsen Saraiva Câmara8
RESUMO Objetivo: Investigar o papel das células-tronco mesenquimais na fibrogênese utilizando um modelo de insuficiência renal crônica. Métodos: As células-tronco mesenquimais foram obtidas de tíbias e fêmures de ratos Wistar-EPM. Após três a cinco passagens, as células foram submetidas a análises fenotípicas e diferenciação. Ratas Wistar foram submetidas ao modelo de nefrectomia, 5/6 e 2.105 células-tronco mesenquimais foram administradas por via intravenosa a cada duas semanas, até a oitava semana. Resultados: A expressão do gene SRY (sex-determining region Y) foi observada em ratas tratadas com célulastronco oriundas dos machos. Soro e análises de urina mostraram melhora dos parâmetros funcionais nos animais tratados, como redução dos ní veis de creatinina, ureia sérica e proteinúria. Além disso, o hematócrito mostrou melhora da anemia nos animais tratados com células-tronco mesenquimais. Tricrômico de Masson e Picrosirius Red demonstraram níveis reduzidos de fibrose nos animais tratados com células-tronco mesenquimais. Esses resultados se correlacionam com a expressão reduzida do RNAm de vimentina, colágeno I, TGFβ, FSP-1, MCP-1 e Smad3. Níveis do RNAm de IL-6 e TNFa diminuíram significativamente após o tratamento com células-tronco mesenquimais, enquanto a IL-4 e IL-10 se apresentaram maiores após tratamento. A expressão sérica de IL-1α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, TNF-α e IL-10 se apresentaram diminuídas nos animais tratados. Conclusões: Em conjunto, esses resultados sugerem que a terapia com células-tronco mesenquimais pode, efetivamente,
modular a resposta inflamatória que se segue à fase inicial de uma lesão renal crônica. Os papéis imunossupressores e remodeladores das células-tronco mesenquimais podem estar envolvidos na melhoria do resultado de fibrose. Descritores: Células-tronco mesenquimais; Insuficiência renal aguda; Ratos Wistar
ABSTRACT Objective: To investigate the role of mesenchymal stem cells in fibrogenesis using a model of chronic renal insufficiency. Methods: Mesenchymal stem cells were obtained from tibias and femurs of Wistar-EPM rats. After three to five passages, the cells were submitted to phenotypic analyses and differentiation. Wistar rats were submitted to the 5/6 nephrectomy model, and 2.105 mesenchymal stem cells were administered intravenously to each rat every two weeks until the eighth week. Results: Sex-determining region Y was observed in female rats treated with stem cells. Serum and urine analyses showed improvement of functional parameters in mesenchymal stem cells treated animals, such as creatinine, serum urea, and proteinuria. Moreover, hemocrit analysis showed improvement of anemia in mesenchymal stem cells treated animals. Masson’s Trichromium and Picrosirius Red staining demonstrated reduced levels of fibrosis in mesenchymal stem cells
Trabalho realizado no Departamento de Nefrologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil. 1
Doutora; Disciplina de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Mestre; Disciplina de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Mestre; Disciplina de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Doutora; Pesquisadora do Departamento de Patologia da Universidade de São Paulo – USP, São Paulo (SP), Brasil; Professora convidada da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – FCMSCSP, São Paulo (SP), Brasil.
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Doutora; Biomédica do Departamento de Nefrologia da Universidade de São Paulo – USP, São Paulo (SP), Brasil.
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Doutor; Professor do Departamento de Nefrologia da Universidade de São Paulo – USP, São Paulo (SP), Brasil.
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Livre-docente; Professor Adjunto da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Livre-docente; Professor-associado do Departamento de Imunologia da Universidade de São Paulo – USP; Disciplina de Nefrologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
Autor correspondente: Niels Olsen Saraiva Camara – Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo – Avenida Professor Lineu Prestes, 1730 – ICB IV – Cidade Universitária – CEP 05508-900 – São Paulo (SP), Brasil – Tel.: 11 3091-7388 – E-mail:
[email protected] Os autores informam que não há conflito de interesse. Data de submissão: 28/4/2009 – Data de aceite: 6/10/2009
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treated in animals. These results were corroborated by reduced vimentin, collagen I, TGFβ, FSP-1, MCP-1 and Smad3 mRNA expression. Renal IL-6 and TNFα mRNA expression levels were significantly decreased after mesenchymal stem cells treatment, while IL-4 and IL-10 expression were increased. Serum expression of IL-1α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, TNF-α, and IL10 was decreased in mesenchymal cell-treated animals. Conclusions: Altogether, these results suggest that mesenchymal stem cells therapy can indeed modulate the inflammatory response that follows the initial phase of a chronic renal lesion. The immunosuppresive and remodeling properties of the mesenchymal stem cells may be involved in the improved fibrotic outcome. Keywords: Mesenchymal stem cells; Renal insufficiency, acute; Rats, Wistar
INTRODUÇÃO A prevalência de doença renal crônica (DRC) vem crescendo no mundo. Campanhas mundiais do Dia do Rim (2007 e 2008) apontam a relevância do tema(1-2). Estima-se que de 5 a 9% de toda população mundial adulta possua algum dano renal, possuindo alta mortalidade em pacientes cardiovasculares que possuam DRC. Dentre as consequências de DRC, há a perda do rim, complicações decorrentes da diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) e aumento do risco de doenças cardiovasculares. As complicações decorrentes da redução da TFG incluem hipertensão, anemia, desnutrição, problemas ósseos e alteração no balanço dos minerais, neuropatias e diminuição da qualidade de vida(3). A progressão de DRC pode levar ao estágio final da doença renal (ESRD, do inglês end-stage renal disease), que requer transplante ou diálise(4). No transplante, complicações tempo-dependente também levam a um quadro de ESRD, denominado nefropatia crônica do enxerto (NCE). Todas as etapas da DRC estão presentes, porém mais aceleradas, sendo que em dez anos de transplante, a ESRD está presente em 58,4% dos casos, com esclerose em 37,3% dos glomérulos(5-6). A patogênese da progressão da doença renal (PDR) é de grande complexidade, porém é válido ressaltar que, independentemente da etiologia da doença original, a PDR é resultado de um processo patogenético que conduz a uma via final comum, na qual a glomerulosclerose e a fibrose intersticial aparentemente têm papéis fundamentais(7-9). As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram isoladas inicialmente em 1976, por Friedenstein et al.(10), como células da medula óssea com capacidade de formar unidades de colônia semelhantes a fibroblastos in vitro (CFU-F). Em 1991, Caplan definiu o termo CTM como uma célula capaz de dar origem a outras linhagens de células diferentes da sua origem(11). Em 2005, padronizando a nomenclatura, o Comitê de Células-tronco Meeinstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
senquimais e dos Tecidos da Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) definiu as CTMs como: - CTMs devem ser aderentes ao plástico quando mantidas em cultura; - CTMs devem expressar CD105, CD73 e CD90, e não expressar os marcadores CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR; - CTMs devem se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro(12). Especificamente em nefrologia, as CTMs têm sido utilizadas em modelos experimentais de lesão renal aguda (LRA), de glomerulonefrite e de obstrução unilateral do ureter. Muitos dos estudos realizados com células-tronco (CTs) buscavam analisar o papel dessas células em auxiliar na regeneração tubular após o dano tubular, quer seja tóxico, quer seja isquêmico. Para tanto, realizavam a ablação da medula óssea de um animal e reconstituí am-no com células marcadas com GPF, β-Galactosidase (β-Gal), ou realizam a reconstituição em animais de diferentes sexos (macho→fêmea), buscando assim a presença do cromossomo Y. Os trabalhos que realmente utilizaram CTs como terapia, ou seja, administrando CTs de fonte exógena para LRA, demonstraram ótimos resultados. Morigi et al. testaram a hipótese de que o tratamento com CTM, ou células-tronco hematopoiéticas (CTH) de medula óssea, poderia melhorar a função renal e atenuar a lesão tubular em animais com insuficiência renal aguda (IRA) tóxica. Camundongos fêmeas receberam CTM ou CTH intravenosa, de animais machos, um dia após a injeção com cisplatina. A análise com hibridização com o cromossomo Y mostrou presença de CTM na região dos túbulos renais proximais, expressando marcadores de superfície com a lectina (Lens culinaris), indicando migração e reparo do rim agredido. As CTMs, mas não as CTH, foram capazes de induzir proliferação tubular e restaurar a arquitetura renal(13). Duffield et al. injetaram CTM por via intravenosa em camundongos e notaram que houve melhora no quadro da IRA. Não foi encontrada nenhuma CTM no rim. Sugeriu-se que CTMs possam auxiliar no reparo pela modulação da resposta inflamatória, pois CTMs desaparecem rapidamente da circulação, podendo ser ingeridas pelas células do sistema imune do baço e fígado(14-15). Apesar dos mecanismos serem ainda pouco compreendidos, sugere-se que possam regenerar os tecidos ao secretar fatores tróficos, ao se fundirem com células lesadas ou ao se diferenciarem em novas células residentes renais. A grande maioria dos resultados, entretanto, indica que os efeitos de reparo das CTM exógenas não são explicados pela repopulação/fusão direta das CTs aos túbulos(14,16-17). O tempo das análises realizadas nos animais, na maioria dos estudos, foi de 24 a 48 horas,
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o que é muito rápido para que tais efeitos protetores sejam justificados pela transdiferenciação/fusão de células extrarrenais em células epiteliais(16,18-19). Fatores parácrinos secretados pelas CTM podem explicar os efeitos benéficos em lesões agudas renais. Togel et al. encontraram significativos níveis de VEGF, HGF e IGF-1 nos rins dos animais tratados com CTMs(17,20). Outro fator que talvez justifique as melhoras funcionais observadas após a administração de CTMs seja o papel imunomodulador das CTs, visto que a lesão de I/R tem um claro quadro inflamatório, como já mencionado anteriormente. Altos níveis de citocinas anti-inflamatórias foram encontrados em tecidos renais de animais tratados com CTM após isquemia e reperfusão (IR) renal(21-22). O papel das CTMs no processo de fibrogênese renal é desconhecido. Em modelos experimentais da síndrome de Alport alguns resultados foram animadores. Sabe-se que o colágeno IV é o principal componente da membrana basal glomerular. A síndrome de Alport decorre de mutações no colágeno IV. Sendo assim, pesquisadores fizeram um animal knockout para colágeno IV da cadeia A3 (Col4A3-/-), criando assim um modelo animal para a síndrome de Alport. Nesses animais Col4A3-/-, o transplante de medula óssea proveniente de animais normais resultou em melhora nos parâmetros histológicos e funcionais, com redução significativa dos níveis de proteinúria, levando a uma restauração parcial da expressão de colágeno IV cadeia alfa 3, concomitante à expressão de colágeno IV cadeia alfa 4 e 5, melhorando a estrutura glomerular(23). Em outro estudo, pesquisadores administraram semanalmente CTMs no mesmo modelo da síndrome de Alport (Col4A3-/-) e os dados indicaram que houve um reparo na membrana basal defeituosa, além de prevenir a perda dos capilares peritubulares e reduzir os marcadores de fibrose, embora uma melhora dos parâmetros funcionais não tenha sido obtida: dosagem de creatinina, proteinúria e curva de sobrevivência(24). Em outros órgãos sólidos, o número de trabalhos experimentais é maior. Em modelos crônicos de doença cardí aca, a administração do meio condicionado das CTMs diminuiu a fibrose, indicando que um efeito parácrino das CTMs in vivo. Quando analisado in vitro esse fenômeno, houve diminuição da expressão de colágeno I e III e diminuição da proliferação de fibroblastos cardíacos quando mantidos em cultura com o meio condicionado(25). A administração de CTMs em modelo de doença hepática crônica também resultou em menor expressão de colágeno, melhora dos parâmetros funcionais com elevação dos níveis de albumina sérica, e diminuição dos níveis de ALT (alanina aminotransferase) sérico(26). Os autores sugerem que tal melhora decorra do enxerto das CTMs na região lesada levando a mudança no microambiente do tecido hepático fibrosado. Com sua capacidade de modular diversas respostas, as CTMs poderiam ainda
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modular as CTHs. CTHs, quando ativadas, são a maior fonte de secreção de colágeno, além de gerarem um desbalanço entre metaloproteinases(27-28). Buscando analisar o mecanismo responsável por tal proteção, Parekkadan realizou ensaio de co-cultura entre CTMs e células residentes do fígado, a célula hepática estrelada. Nesse sistema de co-cultura indireta, as células hepáticas estreladas ativadas em contato com as CTMs expressaram menos colágeno e apresentaram menor proliferação. Ainda, células hepáticas ativadas apresentaram maior morte por apoptose, indicando, portanto, que CTM pode modular a célula hepática por uma via parácrina(29). Modelos de fibrose pulmonar também foram estudados, e novamente foi observada uma redução na deposição de colágeno e na diminuição do quadro inflamatório após o tratamento com CTMs(30-31). Ainda, outro grupo demonstrou que, após a administração de CTMs no modelo de doença pulmonar crônica, as CTMs não assumiram o fenótipo de células pulmonares; entretanto, também observaram que a proteção era mediada por uma diminuição do quadro inflamatório, levando a expressão de fatores de crescimento(32). Por outro lado, Kunter et al. analisaram se as CTMs eram capazes de preservar a estrutura renal no modelo renal de glomeronefrite, induzido por anticorpo anti-Th1.1. Precocemente, as CTMs induziram a melhora funcional e histológica no modelo animal. Porém, em longo prazo, vesí culas adiposas apareceram no glomérulo. Provavelmente as CTMs se maldiferenciaram em adipócitos, enquanto o quadro de esclerose glomerular foi se estabelecendo(33). Trabalhos recentes, entretanto, demonstraram melhora funcional e estrutural no tratamento com CTMs e células de linhagem negativa (Lin-) terapeuticamente, em um outro modelo de DRC, o modelo de nefrectomia 5/6. O tratamento pontual com células da medula óssea ou mesmo CTM no parênquima renal resultou em maiores TFG e diminuição da proteinúria, sem mudanças na histologia(34). Já o tratamento com células Lin- resultou em melhora nos índices de proteinúria, glomerulosclerose, anemia, infiltração de células imunes no tecido renal e menor expressão de MCP-1(35). Em trabalho semelhante, porém um modelo de nefrectomia 5/6 diferente (nesse experimento, o modelo de 5/6 foi obtido por meio da nefrectomia total do rim direito e, no rim esquerdo, o rim foi previamente clampeado por 40 minutos, seguido de reperfusão e ablação de metade do rim), Choi et al. também observaram melhora na proteinúria e menor índice de glomeruloesclerose nos animais tratados com CTMs, após 4 meses(36). Nos modelos de DRC, portanto, não está claro qual o papel das CTMs(37). Os trabalhos na literatura são reduzidos e controversos. Buscando analisar qual o papel das CTMs na DCR, administramos as CTMs no modelo de nefrectomia 5/6 e avaliamos os mecanismos inflamaeinstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
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tórios e fibróticos, bem característicos da PDR, que podiam estar relacionados com a modulação do processo fibrogênico pelas CTMs.
OBJETIVO Analisar o papel imunomodulador e antifibroblástico das CTMs num modelo de doença renal cônica, a ablação renal. MÉTODOS Isolamento e caracterização das CTMs Ratos machos Wistar, de aproximadamente 150 g, foram sacrificados e tiveram suas medulas óssea do fêmur e da tí bia retiradas. A medula óssea foi lavada com PBS estéril e acomodada em tubo de 15 ml estéril. Em fluxo laminar, o material coletado foi lavado com PBS estéril 3 vezes (900 g, dois minutos). O material foi ressuspendido em 4 ml meio DMEM-low glucose (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Para a separação da fração mononuclear da medula óssea, o material ressuspendido foi submetido ao protocolo do Histopaque (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). A 4 ml de Histopaque, foram adicionados, delicadamente, 4 ml do material coletado e centrifugado a 400 g por 30 minutos. Após a centrifugação, forma-se uma interface entre o Histopaque e o meio DMEM que contém as células mononucleares. Estas são selecionadas e lavadas com PBS por cinco vezes (900 g, cinco minutos). O pellet formado foi então ressuspendido em DMEM-low glucose, suplementado com soro fetal bovino a 10% (Cultilab, Campinas, Brasil). Foram plaqueadas 2x105 células por mm2 de superfície. As células foram mantidas em cultura, 5% CO2, 37 ºC, por 10 a 15 dias. Imunofenotipagem das CTMs As CTMs foram removidas das placas de cultura pela utilização de tripsina 10%, e contadas por meio da câmara de Neubauer. Aproximadamente 5.105 células foram incubadas por 30 minutos, a 4 ºC com o anticorpo para marcação de moléculas de superfície CD45 (BD Biosciences, San Jose, Estados Unidos), CD44 (BD), CD73 (BD), CD29 (BD), CD 31 (BD), CD34 (Santa Cruz, Santa Cruz, Estados Unidos) e CD 90 (BD), na diluição de 1:10. Após esse período, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas (1% paraformaldeído, 0,1% azida sódica e 0,5% SFB). Foram analisadas em FACSCalibur flow cytometer (BD). Diferenciação das CTMs de ratos Em relação aos ensaios de diferenciação, para a caracterização funcional das CTs, foram empregados einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
dois testes de plasticidade. Diferenciação adipogênica: CTMs da primeira ou segunda passagem foram cultivadas em placas de seis poços com meio de cultura DMEM até atingirem confluência. Nesse ponto, o meio de cultura DMEM foi trocado pelo meio de cultura de indução de adipogênese, que consiste em meio DMEM (alta glucose, 4,5 g/l), suplementado com 1 µM de dexametasona (Sigma), 10 µM de indometacina (Sigma), 10 µg/ml de insulina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (Sigma) e 10% de SBF, por três dias. Em seguida, o meio de indução de adipogênese foi trocado por um meio de manutenção – DMEM (alta glucose, 4,5 g/l) suplementado com 10 µg/ml de insulina e 10% de SBF. Essa estimulação foi repetida duas vezes, num total de 18 dias de tratamento. As células de controle foram cultivadas no meio DMEM suplementado apenas com 10% SBF. Os níveis de diferenciação foram examinados por microscopia e exames histológicos. A análise da expressão de genes específicos de adipogênese, como o PPAR-γ, foi realizada no 18º. dia de diferenciação. Diferenciação osteogênica: a diferenciação osteogênica foi induzida na primeira ou segunda passagem da cultura das CTMs. As CTMs foram incubadas com meio de cultura contendo 0,1 µM dexametasona, 10 mM de sódio β-glicerofosfato e 0,2 mM de ácido ascórbico (Sigma). O meio foi trocado a cada três dias, e as células mantidas em cultura por 24 dias. O nível da diferenciação osteogênica foi analisado por microscopia por meio da coloração Von Kossa.
Modelo do rim remanescente (nefrectomia 5/6) Técnica operatória: em animais anestesiados por ketamina/xilazina, realizou-se a laparotomia e exposição do rim esquerdo. Antes da cirurgia, coletou-se sangue via retro-orbital. Realizou-se a ligação de dois dos três ramos da artéria renal esquerda, para isquemia de aproximadamente 2/3 do rim. Após duas semanas, o mesmo animal foi submetido a nefrectomia direita. Ao grupo de animais tratados com CTMs, foram administradas 2.105 CTMs endovenosamente (veia da cauda) na segunda, quarta e sexta semanas. Os animais foram sacrificados na oitava semana. A utilização dos animais foi aprovada pelo Comitê de Ética da UNIFESP (2006/0210). Avaliação da função renal: creatinina, sérica e urinária foram analisadas pelo método de Jaffé. Já a ureia sérica foi dosada pelo kit Urease (Labtest). Para quantificar a quantidade de proteína na urina de 24 horas, as amostras foram submetidas ao kit Sensiprot (Labtest). A albumina sérica foi dosada no intuito de observar indiretamente a excreção de albumina, assim como analisar o estado nutricional dos animais e função hepática. Para tanto, utilizou-se o kit Albumina colorimétrico (Labtest). A glicemia sérica foi dosada por meio do kit
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Glicose PAP Liquiform (Labtest). O colesterol total foi dosado nos soros dos animais na oitava semana por meio do kit Colesterol Liquiform (Labtest). Clearance de inulina: para determinar a taxa de filtração glomerular (TFG), foram realizados ensaios de clearance de inulina. No dia do sacrifício (oitava semana), os animais foram anestesiados intraperiotonealmente com pentobarbital (50 mg/kg de peso corpóreo). A traqueia foi canulada com um cateter PE-240, e os animais mantidos em respiração espontânea. Para manter a pressão arterial e permitir a coleta de sangue, um cateter PE-60 foi inserido na artéria carótida direita. Para a infusão de inulina e fluidos, outro cateter PE-60 foi inserido na veia jugular esquerda. Com a finalidade de coletar amostras de urina, uma incisão suprapúbica foi feita e a bexiga canulada com um cateter PE-240. Após o procedimento cirúrgico estar completo, uma dose de inulina (100 mg/kg de peso corpóreo diluído em solução salina) foi administrada através da veia jugular. Subsequentemente, uma infusão constante de inulina foi iniciada (10 mg/kg peso corpóreo em solução salina) e permaneceu até o fim do experimento, em uma velocidade de 0,04 ml/min. Três amostras de urina foram coletadas em intervalos de 30 minutos. As amostras sanguíneas foram obtidas no início e no final do experimento. A pressão sanguínea foi mensurada no começo do experimento, bem como o hematócrito. A inulina sérica e da urina foi determinada pelo método de antrona. As TFG foram expressas em ml/min/100 g.
Análise de fibrose histomorfométrica Os rins foram retirados, em condições assépticas, porém não estéreis, com os animais sobre efeito de anestésico (ketamina-xilazina). Depois de seccionada e retirada a cápsula renal, o rim foi cortado e fixado em formol tamponado a 10% até a montagem em blocos de parafina. Fragmentos de 3 µm foram corados com Tricromo de Masson, no qual a fibrose intersticial foi caracterizada pela expansão da matriz celular com distorção, colapso e espessamento da membrana basal. Além disso, cortes de 3 µm foram corados para Picrosirius, a fim de quantificar colágeno I e III presentes nos rins. As lâminas também foram coradas com ácido periódico de Schiff (PAS) para análise de glomeruloesclerose. As lâminas foram analisadas pelos patologistas em ensaio cego. Análises de transcritos gênicos O tecido renal foi macerado em Trizol e processado de acordo com o procedimento do fabricante. O cDNA foi obtido por meio da enzima M-MLV Reverse Transcriptase (Promega). Para amplificar o transcritos gênicos, utilizaram-se primers TaqMan (Applied Bio-
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system) para vimentina (Rn00579738_m1), TIMP-1 (Rn01430875_g1), MMP-9 (Rn01423075_g1), fibronectina (Rn01401510_m1), HO-1 (Rn00561387_m1), IL-1b (Rn00580432_m1), IL-4 (Rn01456866_m1), IL-6 (Rn00561420_m1), IFNg (Rn00594078_m1); IL-10 (Rn00563409_m1), TNFa (Rn99999017_m1), HGF (Rn00690368_m1), HPRT (Rn01527838_g1).
Análise das citocinas do soro dos animais O painel usado foi o Rat 9 Plex (Bio-Rad, Hercules, Estados Unidos), analisando as citocinas IL-1β, IL1α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α. O ensaio foi desenvolvido de acordo com o protocolo do fabricante. Análise estatística Os dados foram apresentados em gráficos, e mostram média e desvio padrão (DP). Os testes t de Student, de Mann-Whitney e ANOVA foram usados para comparar os dados. Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas com valor de p menor que 0,05. RESULTADOS Isolamento e cultivo das CTMs Ratos de aproximadamente 120 a 150 g (quatro semanas) foram utilizados para o isolamento de CTMs . Na figura 1, pode-se observar que as CTMs em cultura formaram colônias e as CFU-F, que também caracterizam a obtenção dessas células. Analisou-se a expressão de CD44, CD45, CD31, CD34, CD29, CD73 e CD90 por citometria de fluxo. Como descrito, foram expressos CD44, CD29, CD90 e CD73 e as demais não. Os resultados podem ser visualizados na figura 2. As células foram incubadas com os anticorpos conjugados com FITC, PE-Cy7 ou PE e analisados no FASCanto (BD Biosciences). Em cada ensaio, 50 mil células foram adquiridas pelo citômetro FACS Canto (BD Biosciences). Além da imunofenotipagem, a caracterização das CTMs foi analisada pela diferenciação das CTM em outras células, como adipócito e osteócito. Seguindo protocolos descritos por Pittenger et al.(38), as células foram incubadas com meio que induziu a diferenciação para adipócito, sendo posteriormente coradas pelo método de Oil Red, com o qual é possível visualizar vesículas adiposas presentes nas células. As células também foram diferenciadas para osteócito. Por meio da coloração de Von Kossa, pudemos analisar algumas células com depósito de cálcio (Figura 3). einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
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Figura 1. Células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea de tíbias e fêmur de ratos machos. Em A, CTMs na primeira passagem. Em B, CTMs na segunda passagem. Em C, imagem das CTMs cultivadas por quatro semanas e coradas com hematoxilina de Harris, no qual pode-se observar a formação de colônias.
Figura 3. CTM de rato diferenciadas para adipócitos (A) corados. Em A, CTMs diferenciadas para adipócito coradas com Oil Red e contracoradas com Hematoxilina de Harris e seu controle (B). Em C, CTM diferenciadas para osteócito, coradas pela técnica de Von Kossa, e seu controle, em D.
com CTMs, bem como redução da razão entre proteína e creatinina urinária. Os valores representam a média aritmética ± desvio padrão, com n = 7 e sham com n = 5 (p < 0,05). Para o clearance de inulina, um grupo com n = 4 animais foi utilizado. Entretanto, o clearance de inulina não apresentou diferença significativa, apesar de mostrar um pequeno aumento nos animais tratados com CTMs (0,25 ± 0.04 versus 0,34 ± 0,009 ml/min/100 g, respectivamente, p = 0,25). Esses resultados são apresentados na figura 4 (A, B, C e D). Para verificar se o tratamento levou a modificações sistêmicas, analisamos os parâmetros bioquímicos tais como albumina sérica, colesterol total e glicemia. Foram medidos ainda os dados pressóricos e o hematócrito. Os dados pressóricos, de albumina sérica e glicemia não demonstraram diferenças estatísticas; entretant,o o hematócrito dos animais tratados se mostrou significativamente mais elevado, como pode ser observado na tabela 1. Interessantemente, o colesterol total apresentou-se reduzido nos animais tratados com CTM, na oitava semana (Tabela 1). Figura 2. Análise da expressão de CD44, CD45, CD34, CD29, CD31, CD73 E CD90. Em (A), observa-se a população de células (P1) selecionada para análise, utilizada em todas preparações. De (B) a (H), temos a análise das células em histogramas, analisando a intensidade de fluorescência, buscando assim observar a presença do fluoróforo, de acordo com o anticorpo utilizado. A linha cinza mais clara demonstra o perfil das CTMs não marcadas e, em preto, as mesmas CTMs marcadas com o anticorpo conjugado. Em (B), CD90; em (C), CD29; em (D), CD44; em (E), CD34; em (F), CD45; em (G), CD73 e em (H), CD31.
Análise funcional Pode-se observar uma diminuição significativa dos níveis de creatinina e ureia séricas nos animais tratados einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
Análises histomorfométricas e expressão de moléculas relacionadas à fibrose Uma vez que o tratamento resultou em melhora funcional, analisamos se essa melhora se refletia em modificações do padrão de fibrose. Para tanto, foi quantificado o grau de fibrose por diferentes técnicas histológicas. As análises morfométricas foram realizadas por um patologista em ensaio cego. Os valores são médias aritméticas ± desvio padrão, com n = 7 para cada grupo, e n = 5 para os shams, p < 0,05. As colorações de Masson e Pi-
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Tabela 1. Análises séricas de glicemia, colesterol total, albumina sérica, pressão sanguínea e hematócrito em animais nefrectomizados, tratados ou não com CTMs, após oito semanas Animais Sham Nx NxCTM
Pressão sanguínea (mmHg) 160 ± 5b 218 ± 10b 208 ± 14
Hematócrito (%) 51,5 ± 1.5 47,0 ± 1.4a 53,5 ± 1.9a
Glicemia* (mg/dl) 148,3 ± 11,8 136 ± 12,2 134,5 ± 9,6
Colesterol total* (mg/dl) 97,9 ± 9,27b 151,4 ± 15,07a,b 116,6 ± 15,8a
Albumina sérica (mg/dl) 2,96 ± 0,04b,c 2,08 ± 0,18b 2,02 ± 0,10c
*análise não-realizada em jejum. Sham: grupo de animais apenas submetido à laparotomia e manipulação dos rins; Nx: animais nefrectomizados sem tratamento; NxCTM: animais nefrectomizados e tratados com CTMs na segunda, quarta e sexta semanas; a: p < 0,05 Nx versus NxCTM; b: p < 0,05 control versus Nx; c: p < 0,05 control versus NxCTM.
Figura 5. Análise histomorfométrica dos tecidos renais dos animais nefrectomizados após oito semanas. Os rins foram corados para Picrosirius (A, D e E); Tricômio de Masson (B, F e G) e para PAS (C, H e I).
Figura 4. Análise funcional dos animais nefrectomizados após oito semanas, tratados ou não com CTMS. Em A, observamos que os animais tratados com CTM possuem menor nível sérico de creatinina que o animal não tratado. Em B, houve a mesma resposta em relação ao nível de ureia sérica. Em C, temos a razão de proteína/creatinina urinária. Em D, temos o clearance de inulina desses animais.
crosirius permitiram quantificar as fibras colágenas e a de PAS, a glomerulosclererose. O tratamento com CTMs no modelo de nefrectomia 5/6 levou significativamente a uma redução da fibrose tecidual. Esses resultados são demonstrados na figura 5 (A-C), além de imagens representativas de cada condição (Figura 5, D-I). O padrão observado na análise histológica se repetiu na quantificação de moléculas relacionadas ao processo de fibrose. Os cDNA dos rins dos animais foi obtido e submetido à amplificação de determinados genes de forma quantitativa por real time PCR. Os valores são médias aritméticas ± desvio padrão, normatizados pela expressão de HPRT e calculados por ∆∆Ct, em relação a um animal controle, com n = 5 para cada grupo, p < 0,05.
O tecido renal dos animais tratados com CTM apresentou menores níveis de vimentina (Figura 6A), colágeno 1 (Figura 6C), TGF-β (Figura 6E), FSP-1 (Figura 6F), Smad 3 (Figura 6H) e MCP-1 (Figura 6I). As demais moléculas analisadas, colágeno 3 (Figura 6D), α-SMA (Figura 6G) e fibronectina (Figura 6J) apresentaram uma tendência a menor expressão quando comparados os animais tratados com os animais não tratados, porém sem significância estatística. O remodelamento tecidual também se apresenta alterado, pois a razão TIMP-1/ MMP-9 se apresentou bem reduzida nos animais Nx tratados com CTMs (Figura 6B).
Presença das CTMs no tecido renal Como o modelo foi desenvolvido em fêmeas, e como foram administradas CTMs de machos, buscou-se a expressão do gene SRY no tecido renal. E como se pode observar na figura 7, houve na maioria dos animais do grupo uma expressão de SRY, embora tenham recebido o mesmo tratamento, com as mesmas CTMs em cada administração, podendo-se observar uma expressão diferencial. Visto que as CTMs se encontram no tecido renal, analisaram-se algumas moléculas que estariam einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
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possivelmente modulando essa resposta. Foram analisadas algumas moléculas antifibróticas, tais como HGF, Smad 7, BMP-7 e HO-1. Destas, apenas HGF e HO-1 se apresentaram significativamente mais expressas no tecido renal após tratamento com CTM (Figura 8). Os valores apresentados são médias aritméticas do ∆∆CT ± desvio padrão, normatizados pela expressão de HPRT e calculados por ∆∆ Ct, em relação a um animal controle, com n = 5 para cada grupo, p < 0,05.
Figura 6. Análise de diversos transcritos gênicos relacionados a fibrose por real time PCR. Os genes amplificados foram: (A) vimentina, (B) TIMP-1/MMP-9, (C) colágeno-1, (D) colágeno-3, (E) TGF-b, (F) FSP-1, (G) a-SMA, (H) Smad3, (I) MCP-1 e (J) fibronectina.
IL-6 e TNF-α se encontram menos expressas nos tecidos renais dos animais tratados com CTMs (Figuras 9B e 9F, respectivamente). E, inversamente, as citocinas Th2 (anti-inflamatórias) se apresentaram mais expressas, entre as analisadas, IL-4 (Figura 9 C) e IL-10 (Figura 9 D).
Figura 8. Genes protetores expressos tecido renal após oito semanas. A expressão do RNAm foi realizada por meio de Real Time PCR para os genes de heme-oxigenase 1 (HO-1) em (A), BMP-7 em (B), Smad7 em (C) e HGF em (D).
Figura 7. Presença do gene do cromossomo y (SRY) nas fêmeas tratadas com células-tronco mesenquimais de macho.
Análises da expressão de citocinas no tecido renal e no soro dos animais Sabendo-se do papel imunomodulador das CTMs, quantificamos algumas citocinas no tecido renal dos animais tratados ou não com CTMs. Os valores representam médias aritméticas do ∆∆CT ± desvio padrão, normatizados pela expressão de HPRT e calculados por ∆∆Ct, em relação a um animal controle, com n = 5 para cada grupo, p < 0,05 (Figura 9). Pudemos observar que einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
Figura 9. Expressão do RNAm de citocinas no tecido renal. Por Real Time PCR, analisamos a expressão do RNAm de IFNγ (A), IL-6 (B), IL-4 (C), IL-10 (D), IL-1β (E) e TNFα (F)
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Após oito semanas, os animais foram sacrificados e o soro coletado e analisado por Multiplex. Então, ao se analisar o perfil de citocinas do soro dos animais, observou-se que todas citocinas analisadas se apresentaram menos expressas nos animais tratados com CTMs (Figura 10). Os valores representam médias aritméticas ± desvio padrão, com n = 4 para cada grupo, p < 0,05.
Figura 10. Quantificação sérica de citocinas. Houve uma diminuição significativa de todos os níveis de citocinas dos animais tratados com CTM. Em (A) IL-1 a; (B) IL-1 b; (C) IL-6; (D) IL-10 ; (E) IFNg e (F) TNFa
DISCUSSÃO A DRC pode ser considerada hoje uma epidemia, possuindo altas taxas de mortalidade e morbidade, apesar de todos os avanços já obtidos nessas áreas(1,39-41). Portanto, são necessárias formas terapêuticas alternativas. A partir de 1999, os estudos com CTs tomaram conhecimento público pelo seu potencial terapêutico. Muito se alardeou sobre o uso de CTs em diversas doenças. Houve enfoque em CTs embrionárias, uma vez que possuem capacidade de pluripotência. Mas, com os estudos sobre a plasticidade e ausência de resposta imunológica, as CTMs se tornaram atrativas para fins terapêuticos. Os estudos de CT e rim se iniciaram em 2001 com o trabalho de Grimm et al., que analisaram biópsias de transplantes renais de seis receptores do sexo masculino oriundos de doadores do sexo feminino, com enxertos que apresentavam o diagnóstico de NCE(42). Interessantemente, eles observaram que, nos rins dos doadores do sexo feminino, havia células positivas para cromossomo Y, quando analisados por hibridização in situ. Observaram, ainda, que essas células também eram positivas para α-SMA (smooth muscle actin), um marcador de miofibroblastos e também de células mesenquimais, incluindo CTMs. Nesse aspecto, a administração de CTMs vem crescendo como uma perspectiva atraente. A vantagem na utilização das CTMs decorre da facilidade de obtenção,
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rápida expansão em cultura, e especialmente pelo fato das CTMs não serem reconhecidas pelo sistema imune adquirido, permitindo o transplante alogenênico sem risco de rejeição, devido à baixa expressão de MHC de classe I e II(43-45). Entretanto, o mais atrativo da terapia com CTMs são as suas habilidades anti-inflamatórias, regenerativas e imunossupressoras(43,45-46). Neste trabalho, observou-se melhora dos níveis de creatinina e ureia, assim como da proteinúria, com o tratamento com CTMs no modelo de Nx 5/6, indicando um menor dano tecidual no rim dos animais. Isso se refletiu nos níveis do hematócrito, que se apresentaram mais elevados nos animais tratados com CTMs, o que pode sugerir que nos animais tratados com CTMs exista melhora da estrutura tecidual que garanta a expressão de eritropoetina, revertendo o quadro de anemia característico do modelo crônico. Isso condiz com nossos resultados morfológicos, onde observamos menor área fibrótica e menor glomeruloesclerose. Os níveis pressóricos ainda se mantiveram elevados. O modelo de Nx 5/6 leva a ablação de ~80% dos néfrons dos animais. A adaptação dos néfrons remanescentes à nova condição é inevitável, sendo consequência disso a manutenção dos altos índices pressóricos nesses animais, independente do tratamento. Porém, com a administração de CTMs, a estrutura renal não é tão lesada quanto nos animais Nx 5/6 não tratados com CTMs, visto pela menor fibrose intersticial e principalmente pela menor proteinúria. Novos experimentos combinando anti-hipertensivos com CTMs poderão levar à melhoria dos resultados obtidos. Por meio da análise de MCP-1, pode-se inferir que há um menor influxo inflamatório de mononucleares nos animais tratados com CTM, pois MCP-1 é molécula que atrai monócitos/macrófagos. O remodelamento tecidual também se encontra alterado, pois a razão TIMP-1/ MMP-9 se encontra reduzida nos animais tratados com CTMs, indicando que o tecido renal expressa menos TIMP-1 e mais MMP-9, mantendo, portanto, a estrutura renal. Ao analisar a presença da CTM no rim Nx 5/6, observou-se que as CTMs se encontravam no rim. Provavelmente, a administração mais frequente fez com que as CTMs conseguissem ser encontradas no tecido renal, como pudemos observar na presença de SRY no rins das fêmeas tratadas com CTMs de machos. HGF e HO-1 são moléculas expressas pela CTMs, e suas ações no tecido renal fibrosado são bem reconhecidas. HGF inibe a progressão fibrótica, como já foi demonstrado por diversos trabalhos na literatura(47-50). Neste trabalho, observaram-se altos níveis de expressão de HGF nos animais tratados com CTMs, provavelmente expressos pelas CTMs lá presentes, o que pode levar à inibição do processo fibrótico no rim dos animais Nx 5/6. Ainda, em nosso modelo, HO-1 apresenta-se einstein. 2009; 7(4 Pt 1):469-79
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mais expresso nos animais tratados com CTMs. Como as CTMs se encontram no tecido renal, e sabemos que HO-1 é bem expresso pelas CTMs(43,51), pôde-se inferir que o aumento de HO-1 seja decorrente das CTMs presentes no rim, assim como HGF. O papel imunomodulador das CTMs é bem reconhecido em ensaios in vitro. As CTMs aumentam a proporção de células T reguladoras CD4+CD25+, aumentam a secreção de IL-4, induzem a produção de IL-10, atrasam a maturação de células apresentadoras de antígeno (APC), e diminuem a expressão de HLA-DR nas APCs(43,45). Essa ação pode influenciar o desenvolvimento da transição epitélio-mesenquimal (TEM). Chuang et al. analisaram o papel de citocinas na TEM e observaram que, dentre as citocinas testadas por ele, o TNFα mostrava uma alta correlação dose-dependente com a TEM(52). Uma vez que as citocinas pró-inflamatórias encontramse reduzidas nos animais tratados com CTMs, podemos inferir que haja menos TEM, e consequentemente menor progressão fibrótica. No caso deste estudo, isso foi observado por meio das análises de vimentina, TGF-β e Smad3, que na oitava semana se apresentaram reduzidas nos animais tratados com CTMs. A resposta Th1/Th2 se encontra polarizada no tecido renal submetido ao dano crônico nos animais submetidos ao tratamento com as CTMs. Já analisando sistemicamente, observamos reduções importantes nos níveis das citocinas séricas (IL-1α; IL-1β; IL-6; IL-10; IFNγ e TNFα) nesses animais, demonstrando indiretamente que esses animais se apresentam sistemicamente imunossuprimidos. O tratamento com CTMs periodicamente no modelo de 5/6 levou à diminuição da progressão renal e melhora parcial da função renal, por meio da diminuição de áreas de fibróticas, provavelmente decorrente da modulação da resposta inflamatória (diminuição de citocinas Th1 pró-inflamatórias), levando à redução de TEM e mantendo a estrutura tecidual. Interessantemente, o tratamento com CTMs induziu uma imunossupressão sistêmica, que precisa ser mais bem estudada, mas que abre perspectivas para terapias imunossupressoras para transplantes.
cido renal, corroborando o aumento da expressão de HO-1 e HGF, que se correlaciona com as propriedades antifibróticas e ainda, sistemicamente, diminuem a expressão de citocinas séricas, caracterizando provavelmente imunossupressão decorrente do tratamento com CTMs.
CONCLUSÕES O tratamento com CTMs na DRC levou à melhora da função renal, como observado nos reduzidos níveis de creatinina, ureia sérica e proteinúria; reduziu a área fibrótica e reduziu a glomerulosclerose, como observado nas colorações de Masson e Picrosirius; também comprovadas pela diminuição da expressão do RNAm de moléculas fibróticas, principalmente vimentina, colágeno 1, TGF-β, FSP-1, Smad 3, MCP-1 e a razão TIMP-1/MMP-9. As CTMs foram encontradas no te-
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AGRADECIMENTOS Este estudo foi apoiado pelos auxílios da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 04/08226-9, 06/0620-5, e 07/07139-3), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, 573815/2008-9), do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) de Fluídos Complexos, e do Ministério da Saúde (MS/DECIT). Os ensaios foram realizados em colaboração com a Dra. Maria Heloísa Shimizu, do laboratório do Prof. Dr. Antonio Carlos Seguro. REFERÊNCIAS 1. Levey AS, Andreoli SP, DuBose T, Provenzano R, Collins AJ. Chronic kidney disease: common, harmful and treatable--World Kidney Day 2007. Am J Nephrol. 2007;27(1):108-12. 2. Shah SV, Feehally J. The third World Kidney Day: looking back and thinking forward. Clin Nephrol. 2008;69(3):145-8. 3. Levey AS, Stevens LA, Coresh J. Conceptual model of CKD: applications and implications. Am J Kidney Dis. 2009;53(3 Suppl 3):S4-16. 4. Kato S, Chmielewski M, Honda H, Pecoits-Filho R, Matsuo S, Yuzawa Y, et al. Aspects of immune dysfunction in end-stage renal disease. Clin J Am Soc Nephrol. 2008;3(5):1526-33. 5. Nankivell BJ, Borrows RJ, Fung CL, OConnell PJ, Allen RD, Chapman JR. The natural history of chronic allograft nephropathy. N Engl J Med. 2003;349(24):2326-33. 6. Nankivell BJ, Chapman JR. Chronic allograft nephropathy: current concepts and future directions. Transplantation. 2006;81(5):643-54. 7. Zoja C, Abbate M, Remuzzi G. Progression of chronic kidney disease: insights from animal models. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2006;15(3):250-7. 8. Eddy AA, Neilson EG. Chronic kidney disease progression. J Am Soc Nephrol. 2006;17(11):2964-6. 9. Fogo AB. Mechanisms of progression of chronic kidney disease. Pediatr Nephrol. 2007;22(12):2011-22. 10. Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 1970;3(4):393-403. 12. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-7. 13. Morigi M, Imberti B, Zoja C, Corna D, Tomasoni S, Abbate M, et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2004;15(7):1794-804. 14. Duffield JS, Bonventre JV. Kidney tubular epithelium is restored without replacement with bone marrow-derived cells during repair after ischemic injury. Kidney Int. 2005;68(5):1956-61.
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