POLIMORFISMO DE MARCADORES MOLECULARES EM ALGUMAS VARIEDADES DE ALGODÃO CONTRASTANTES PARA RESISTÊNCIA À DOENÇA AZUL Lúcia Vieira Hoffmann (Embrapa Algodão /
[email protected]), Fábio Rodrigo Araújo Pereira (UEPB), Andrezza Miná de Andrade (UEPB), Carlos Eduardo de Araújo Batista (UEPB), Roseane Gomes Jácome (UEPB), Paulo Augusto Vianna Barroso (Embrapa Algodão). RESUMO - Marcadores moleculares são importantes ferramentas para estudo de variabilidade genética. Com o objetivo de obter a distância genética entre variedades brasileiras de algodão, 73 primers RAPD e 48 pares de primers microsatélite foram usados para amplificar DNA das seguintes variedades de algodão: CNPA ITA 90, CNPA 6M, Coodetec 401, Deltaopal e Makina. Os primers RAPD geraram 625 marcadores, sendo 91 polimórficos (15%). Os pares de primers microsatélite testados geraram 99 marcadores, sendo que nove foram monomórficos e 90 polimórficos. A variedade que mais diferiu das demais foi CNPA 6M, de algodão mocó, Gossypium hirsutum var. marie galante, enquanto outras variedades são todas de algodoeiro herbáceo (Gossypium hirsutum var. hirsutum). Os marcadores polimórficos foram utilizados para genotipar 93 indivíduos de uma população F2 resultantes do cruzamento entre Coodetec 401 e CNPA 6M. Utilizaram-se 24 primers RAPD, que geraram 45 marcadores segregando conforme esperado para um caráter mendeliano monogênico em F2. Entre os 36 pares de primers microsatélite, 17 apresentaram segregação mendeliana, sendo 16 codominantes e BNL1317, dominante. Espera-se agregar maior número de marcadores como também classificar as plantas para resistência à doença azul do algodoeiro, uma virose que tem causado danos à cultura do algodão. Palavras-chave: biotecnologia, virose, RAPD. MOLECULAR MARKERS POLYMORPHISMS AMONG SOME BRAZILIAN COTTON VARIETIES RESISTANT AND SUSCETIBLE TO COTTON BLUE DISEASE ABSTRACT - Molecular markers are an important tool to study genetic variability. With the aim to obtain the genetic distance between some Brazilian cotton varieties, 73 RAPD primers and 48 SSR primer pairs were used to amplify DNA from the following varieties: CNPA ITA 90, CNPA 6M, Coodetec 401, Deltaopal e Makina. The RAPD primers generated 625 markers, and 91 (15%) were polymorphic. SSR primer pairs provided 99 markers, and 90 were polymorphic. The most divergent variety was CNPA 6M, which is arboreum cotton (G. hirsutum var Marie Galante). Polimorphic markers were used to genotype 93 individuals of an F2 population from a cross between Coodetec 401 e CNPA 6M. Twenty four primers RAPD provided 45 markers segregating as expected for a monogenic Mendelian trait in the F2 population. Among the 36 SSR primer pairs, 17 presented Mendelian segregation, 16 were codominant and one primer pair, BNL1317, had a pattern of dominant heritance. We expect to achieve a greater number of markers as well as to classify F2 plants to resistance to “cotton blue disease”, a pest causing which has been an obstacle to cotton production. Key words: biotechnology, viruses, RAPD..
INTRODUÇÃO A virose conhecida como doença azul tem causado prejuízos sérios à cultura do algodão, trazendo perdas significativas para os produtores. Existem variedades resistentes; entretanto, cultivares suscetíveis são largamente utilizados. Nestas, o controle é feito através de pulverizações de inseticida para o vetor, o pulgão Aphis gossypii (Glover). O mapeamento molecular desta doença seria facilitado em populações com grande proporção de marcadores segregantes. A principal espécie de algodão cultivada no Brasil é Gossypium hirsutum L., sendo presentes as raças latifolium, que é herbáceo anual e cultivado em todas as regiões do Brasil, e a raça G. hirsutum var. marie galante, conhecido como algodoeiro arbóreo, perene, e é cultivado, no Brasil, apenas na região Nordeste. Esperava-se que variedades de algodoeiro mocó fossem geneticamente mais distantes dos algodoeiros herbáceos do que os algodoeiros herbáceos entre si, porém não se conhecia a resposta de resistência ou suscetibilidade desta variedade à doença azul. Os objetivos deste trabalho foram: 1) estimar o polimorfismo de marcadores entre variedades de algodão cultivado no Brasil, resistentes e suscetíveis à doença azul, para eleger o melhor cruzamento para mapeamento da resistência. 2) Realizar o cruzamento e iniciar trabalho de mapeamento da doença. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas as seguintes variedades brasileiras de algodão: CNPA ITA 90, CNPA 6M, Coodetec 401, Deltaopal e Makina. Amostras de plantas de cada variedade foram avaliadas com os marcadores moleculares RAPD e microsatélites, totalizando nove genótipos. Procedeu-se a extração de DNA conforme descrito por Ferreira e Grattapaglia (1998). As reações de RAPD foram conduzidas em termociclador e preparadas para um total de 25µL por reação, sendo constituídas por 0,2mM de cada dNTP; 5mM de cloreto de magnésio; 50ng de DNA; 0,2µM de primer em Tris-HCl 10mM pH 8,3; KCl 50mM e 1 unidade de Taq DNA polimerase. Foi realizada desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 45 ciclos, cada qual com desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento dos primers a 35°C por 1 minuto e amplificação a 72°C por 2 minutos. Ao final, foi dado um período adicional de 5 minutos a 72°C para que as extensões se completassem. Testaram-se 81oitenta e um primers Operon, sendo sete do kit A (1,2,4,10,13,18 e 20); sete do kit C (6, 8, 9, 10, 12, 18 e 19); quinze do kit E (2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19 e 20); dez do kit M ( 2, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 14, 16 e 18), 20 do kit N (completo), oito do kit P (2, 3, 5, 10, 13, 14, 17 e 18) e 14 do kit Z (Z7 a Z20). Os produtos de amplificação foram separados em eletroforese, em cubas horizontais, em géis contendo 1,4% de agarose em tampão TBE (0,09M de Tris, 0,09M de ácido bórico e 2mM de EDTA). Os géis foram corados com brometo de etídeo 10mg/mL e analisados em transluminador com luz ultra violeta. Para obtenção de marcadores microsatélites, foram testados 48 primers BNL desenvolvidos por Liu et al. (2000a e 2000b). A reação PCR foi realizada em um volume total de 20µL, contendo 20ng de DNA genômico, 0,15µM de cada primer, 200µmol de dNTP, 50mM de KCl, 10mM de Tris-HCl pH 8,3, uma unidade de Taq DNA polimerase. As quantidades de MgCl2 variaram de 2,5 a 3,5mM para cada par de primers. Para amplificação dos marcadores microsatélites, o DNA foi desnaturado, inicialmente, a 95°C por 12 minutos. Seguiram-se 47 ciclos de desnaturação – anelamento - extensão. Nos primeiros 11 ciclos de amplificação, a desnaturação foi feita a 94°C por 15 segundos; a temperatura de anelamento, no primeiro ciclo de 65°C por 30 segundos, diminuindo-se um grau a cada ciclo (touch down), chegando a 55°C no décimo primeiro ciclo; a extensão foi de 72°C por 1 minuto. Outros trinta e seis ciclos foram de 94°C por 15 segundos; 55°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto. Seguiu-se extensão final a 72°C por 6 minutos. Após a reação foram adicionados 5µl de solução contendo 0,05%
de azul de bromofenol, 0,05% de xyleno cianol, EDTA 10mM e formamida 95%. Em seguida, os produtos de amplificação, foram aquecidos em termociclador a 94°C por 5 minutos. Os fragmentos amplificados foram separados em eletroforese vertical em gel de poliacrilamida. A coloração dos géis foi feita com prata segundo metodologia descrita por Creste et al. (2001). A similaridade genética foi obtida através do coeficiente de coincidência simples. Posteriormente, foi feito agrupamento por UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetical averages). RESULTADOS E DISCUSSÃO Dos 81 primers RAPD testados, setenta e três geraram 625 marcadores, sendo 91 polimórficos. Portanto, o polimorfismo foi de 15%. Os primers polimórficos, com os respectivos números de bandas polimórficas, estão apresentados na Tabela 1. Os 48 pares de primers microsatélite BNL geraram 99 marcadores, sendo que nove foram monomórficos e 90 polimórficos. Entre os pares de primers que apresentaram marcadores polimórficos, dois apresentaram quatro alelos (BNL1679 e BNL1721); seis apresentaram três alelos (BNL2496; BNL1665; BNL1317; BNL1434; BNL3563 e BNL3452) e trinta e dois apresentaram dois alelos. A variedade que mais diferiu das demais foi CNPA 6M, como mostram a Figura 1 e a Tabela 2. Este resultado era esperado, por esta ser uma variedade de algodão mocó, Gossypium hirsutum var. marie galante, enquanto as outras variedades são todas de algodoeiro herbáceo, Gossypium hirsutum var. hirsutum. Ela foi então escolhida como um dos pais em um cruzamento para mapeamento de resistência à doença azul. Embora esta variedade aparentemente segregue para resistência à doença azul, a planta utilizada no cruzamento com Coodetec 401 para gerar a população F2 era suscetível e também foi suscetível 100% de sua progênie, mostrando homozigose para resistência à doença. A variedade mais distante geneticamente de CNPA 6M foi Coodetec 401 (Tab. 2). As variedades Deltaopal e Makina foram bastante homogêneas, pois os coeficientes de similaridade entre as duas plantas da mesma variedade, apresentados na Tabela 2, foram próximos a 1,00. COO-1 CCO-2 MÁKINA-1 MÁKINA-2 DELTA-1 DELTA-2 ITA 6M-1 6M-2 0.36
0.52
0.68
0.83
0.99
Coefficient
Figura 1. Agrupamento por UPGMA de variedades de algodão a partir de marcadores RAPD. Coo-1, e Coo-2; Delta1 e Delta-2 e 6M-1 e 6M-2o 1 e 2 correspondem às duas plantas analisadas das seguintes variedades de algodão, respectivamente: Coodetec 401, Deltaopal e CNPA6M.
Tabela 1. Primers avaliados para as variedades Coodetec 401, CNPA 6M, Mákina, ITA 90 e Deltaopal, número de bandas obtidas (N) e número de bandas polimórficas (P). M indica todas as bandas monomórficas. Primer N P Primer N P A1 9 1 N3 5 1 A2 7 1 N4 9 1 A4 14 1 N5 12 4 A10 6 1 N6 7 1 A13 4 1 N7 7 1 A18 7 1 N8 6 M A20 5 M N9 8 2 C6 14 1 N10 12 10 C8 14 M N11 11 6 C9 6 M N12 12 2 C10 15 2 N13 6 M C12 4 1 N14 10 1 C18 5 2 N15 13 1 C19 15 1 N16 10 M E2 14 2 N17 12 5 E3 1 M N18 11 4 E4 1 M N19 10 4 E5 5 1 N20 9 2 E6 9 1 P2 15 1 E7 15 M P3 9 1 E9 1 M P5 3 M E11 6 2 P10 1 M E12 5 M P13 13 M M2 8 M P14 11 M M4 12 1 P17 14 2 M5 6 3 P18 4 M M6 11 1 Z8 6 M M7 8 2 Z9 1 M M8 6 1 Z11 12 3 M11 14 2 Z12 12 1 M14 7 M Z13 3 M M16 10 M Z14 6 M M18 1 M Z15 12 M N1 3 1 Z16 4 1 N2 9 2 Z17 7 2 Z18 6 M Z19 5 M Z20 13 4
Tabela 2. Similaridade genética entre as variedades, Deltaopal, CNPA ITA 90, Mákina, CNPA 6M e Coodetec 401, utilizando marcadores RAPD obtidas pelo coeficiente de Coincidência Simples. Côo-1 Côo-2 6M-1 6M-2 Makina-1 Makina-2 Ita 90 Delta-1 Coo-2 0.865 6M-1 0.131 0.150 6M-2 0.210 0.187 0.906 Makina-1 0.583 0.575 0.456 0.442 Makina-2 0.595 0.588 0.444 0.430 0.989 Ita 90 0.643 0.563 0.400 0.419 0.924 0.934 Delta-1 0.583 0.600 0.478 0.465 0.956 0.945 0.901 Delta-2 0.600 0.635 0.452 0.427 0.929 0.941 0.894 0.976 Os marcadores polimórficos foram utilizados para genotipar 93 indivíduos de uma população F2 resultantes do cruzamento entre Coodetec 401 (resistente à doença azul) e CNPA 6M (planta homozigota para a suscetibilidade à doença azul). Utilizaram-se 24 primers RAPD, que geraram 45 marcadores segregando conforme esperado para um caráter mendeliano monogênico em F2. Entre os 36 pares de primers microsatélite, 17 apresentaram segregação mendeliana, sendo 16 codominantes e BNL1317, dominante. Espera-se agregar maior número de marcadores como também classificar as plantas para resistência à doença azul do algodoeiro, virose que tem causado danos à cultura do algodão. CONCLUSÃO Este trabalho permitiu identificar um cruzamento favorável para o mapeamento da doença azul do algodoeiro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CRESTE, S.; TULMANN NETO, A.; FIGUEIRA, A. Detection of single sequence repeat polymorphisms in denaturing polyacrylamide sequencing gels by silver staining. Plant Molecular Biology Reporter, v. 19. p. 299-306, 2001. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3ª edição. Brasília: Embrapa 1998. 220p. LIU, S. CANTRELL, R. G.; MACCARTY, J. C.; STEWART, J. M. Simple sequence repeat-based assessment of genetic diversity in cotton race stock acessions. Crop Science, v. 40, p. 1459-1469, 2000a. LIU, S.; SAHA, S.; BURR, B.; CANTRELL, R. G. Chromosomal assigment of microsatelite loci in cotton. Journal of Heredity, v. 91, n. 4, p. 326-332, 2000b.
