Projeto vias de sinalizacao MAPKs

UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Allison josé pires



VIAS DE SINALIZAÇÃO DE MAPK's (Mitogen – Activated Protein Kinases) EM TECIDO NEURAL DE CAMUNDONGOS VELHOS TRATADOS COM CAFEÍNA














Criciúma
2013
ALLISON JOSÉ PIRES







VIAS DE SINALIZAÇÃO DE MAPK's (Mitogen – Activated Protein Kinases) EM TECIDO NEURAL DE CAMUNDONGOS VELHOS TRATADOS COM CAFEÍNA





Projeto de Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para o exame de qualificação em Ciências da Saúde.
Orientadora: Prof. Drª Carina Rodrigues Boeck
Co-Orientadora: Prof. Drª Vanessa Moraes de Andrade





Criciúma
2013
1 INTRODUÇÃO

1.1 Envelhecimento

O envelhecimento é um processo biológico inevitável e caracterizado por declínio geral das funções fisiológicas, isto é contrabalançado por reparo e fatores de manutenção que contribuem para a longevidade do organismo. Assim, Beckman e Ames (1998) definiram o envelhecimento como um fenômeno multifatorial associado com a diminuição das funções fisiológicas e celulares, ao aumento na incidência de numerosas doenças degenerativas e à diminuição da capacidade para responder ao estresse.
Fatores biológicos, psicológicos e sociais são alguns dos fenômenos relativos que compreendem o envelhecimento e atingem ao homem e sua existência na sociedade. Tais processos têm uma dimensão existencial que se reveste de características biopsíquicas, sociais e culturais.(Stoppe , 1994).
O processo de envelhecimento pode ser definido como um declínio progressivo das funções fisiológicas de um organismo depois da fase reprodutiva da vida (Valko et al., 2007).
Arking (1991) propôs que o envelhecimento "é uma série de mudanças estruturais e funcionais cumulativas, universais, progressivas e deletérias que usualmente começam a se manifestar mais tarde na vida de um indivíduo". Dentre todas as definições, observa-se uma tendência geral em caracterizar tal processo como heterogêneo, complexo e multifatorial (Gueller e Zenik, 2005).
Em nível celular, o envelhecimento pode ser descrito como mudanças graduais na fisiologia molecular da célula, que provoca uma diminuição das suas funções normais (Mansour et al., 2008). Várias hipóteses sobre os mecanismos de envelhecimento têm sido desenvolvidas, e estes podem não ser uniformes em todas as células e órgãos. Comum à maioria dos modelos de envelhecimento é a ideia de que mudança gradual na estrutura original de DNA é uma causa básica importante. A teoria da mutação somática do envelhecimento propõe que o envelhecimento é devido ao acúmulo de mutações no DNA em células somáticas ao longo do tempo (Mansour et al., 2008).
Apesar do avanço científico, o conhecimento sobre as causas do envelhecimento ainda é muito limitado. Por questões éticas, as pesquisas experimentais não podem ser realizadas em seres humanos e têm sido desenvolvidas em modelos animais, destacando-se os roedores. No entanto, para que os resultados dos trabalhos experimentais tornem-se relevantes para a compreensão do envelhecimento, os mecanismos analisados precisam ser comuns ao ser humano, o que nem sempre acontece (Partridge, 2002).
Várias são as teorias propostas para explicar o envelhecimento. Segundo Medvedev (1990), existem mais de 300 teorias, muitas das quais não se contradizem e até mesmo se apoiam umas nas outras, muito provavelmente por tratarem o assunto sob vários aspectos e de forma diferente e independente.
Teixeira (2010) em seu artigo apresenta uma revisão das teorias biológicas do envelhecimento e discute os mecanismos relevantes para explicar o processo. Weinert e Timiras (2003), propuseram a classificação das teorias e mecanismos biológicos do envelhecimento em três categorias: evolutiva, celular-molecular e sistêmica. O quadro 01 resume a classificação das teorias.
Nas ultimas duas décadas, diversas evidências diretas e indiretas têm demonstrado uma relação positiva entre o aumento do estresse oxidativo in vivo e o envelhecimento. Os estudos demonstraram vários tipos de danos no DNA acumulados durante a idade e as possibilidades de ser o estresse oxidativo o grande contribuinte deste processo, principalmente em roedores (Bonassi et al., 1995; Iarmarcovai et al., 2007; Wojda et al., 2007; Heuser et al, 2008).

Quadro 01. Classificação de algumas teorias biológicas do envelhecimento
TEORIAS
DESCRIÇÃO
EVOLUTIVAS
Acúmulo de mutações



Pleiotropia antagonista



Soma descartável


A seleção natural torna-se "negligente" com as mutações que afetam a saúde em idade avançada.

Os genes benéficos na juventude tornam-se deletérios na fase pós reprodutiva.

As células somáticas são mantidas somente para assegurar o êxito na reprodução, tornando-se descartáveis após este período.

CELULARES – MOLECULARES
Erro catastrófico





Mutações somáticas


Senescência celular/telômeros






Radicais livres/DNA




Glicosilação (AGEs)/ligações cruzadas




Morte Celular



Com o envelhecimento, há um declínio na fidelidade da expressão genética, que resulta na auto amplificação de erros na síntese proteica. O acúmulo desses erros provoca o "erro catástrofe".

Os danos moleculares acumulam-se principalmente no DNA.

O fenótipo do envelhecimento é causado pelo aumento na frequência de células senescentes. A senescência celular pode ser decorrente do encurtamento dos telômeros (senescência replicativa) ou do estresse celular.

O metabolismo oxidativo produz radicais livres altamente reativos que, subsequentemente, causam danos nos lipídios, nas proteínas e no DNA.

O acúmulo de AGEs nas proteínas da matriz extracelular tem consequências deletérias e contribui para o envelhecimento.

A morte celular programada ocorre por eventos genéticos ou em decorrência de crise no genoma.

SISTÊMICAS
Neuroendócrinas



Neuroendócrina/Imunológica



Ritmo/Velocidade de vida




Alterações no controle neuroendócrino da homeostase resultam em mudanças fisiológicas relacionadas à idade.

O declínio da função imune associado ao envelhecimento resulta em incidência maior de doenças autoimunes.

Há um potencial de energia para o metabolismo de cada organismo vivo. "Viva rapidamente e morra jovem."

AGEs: Advanced Glycosylation End-products (AGEs) (produtos finais de glicosilação avançada) Fonte: Teixeira, 2010; Weinert e Timiras 2003.
O envelhecimento é acompanhado por mudanças na função cognitiva e alterações na anatomia do cérebro, fisiologia e neuroquímica. A taxa e a magnitude da mudança, no entanto, varia substancialmente entre o cérebro dos indivíduos, regiões e domínios funcionais (Kosik et al., 2012).
O crescimento da população idosa é um fenômeno mundial e, no Brasil, as modificações ocorrem de forma radical e bastante acelerada (Carvalho, 2003). As projeções mais conservadoras indicam que, em 2020, o Brasil será o sexto país do mundo em número de idosos, com um contingente superior a 30 milhões de pessoas (Veras, 2009).
O número de idosos no Brasil passou de 3 milhões, em 1960, para 7 milhões, em 1975, e 20 milhões em 2008 – um aumento de quase 700% em menos de 50 anos. No ultimo de censo de 2010 revelou que 10,78% da população brasileira é composta por pessoas acima de 60 anos (Brasil, 2010). Conseqüentemente, doenças próprias do envelhecimento passaram a ganhar maior expressão no conjunto da sociedade.
Com o aumento progressivo da expectativa de vida e conseqüentemente do envelhecimento populacional, doenças crônicas degenerativas, em particular os quadros demenciais como a Doença de Alzheimer (DA), se tornaram cada vez mais prevalentes, ocasionando um sério problema para os sistemas de Saúde (Wiltfang et al, 2009).
Um dos resultados dessa dinâmica é a maior procura dos idosos por serviços de saúde. As internações hospitalares são mais freqüentes e o tempo de ocupação do leito é maior quando comparado a outras faixas etárias. Desta forma, o envelhecimento populacional se traduz em maior carga de doenças na população, mais incapacidades e aumento do uso dos serviços de saúde (Veras, 2009).



1.2 Cafeína

A cafeína pertence à classe de compostos conhecidos como metilxantinas (1,3,7-trimetilxantina), (Costa et al., 2008), sendo considerada a substância psicoativa mais utilizada em todo o mundo (Glade, 2010). Após sua ingestão, é absorvida pelo trato digestório, distribuindo-se para todos os tecidos, principalmente para o cérebro, onde exerce suas pricipais ações (Fredholm et al., 1999). Seus produtos metabólicos, através da desmetilação da cafeína, resulta na formação de três grupos metilxantina: a teofilina (4%), a teobromina (12%) e a paraxantina (84%) que, se diferenciam pela sua ação farmacológica sobre o SNC (Davis et al., 2003).
A cafeína é encontrada em vários medicamentos, alimentos e bebidas e tem sido descrita como a droga psicoativa mais utilizada no mundo (Glade, 2010). Muitos dos alimentos e medicamentos que contem cafeína têm apenas quantidades moderadas que não produzem efeitos psicoativos detectáveis (Heckman et al., 2010). Contudo, as bebidas contendo cafeína, tais como café , chá e refrigerantes têm níveis mais elevados, que podem produzir efeitos subjetivos estimulantes (Heckman et ai., 2010). Os recentes aumentos da popularidade dessas bebidas, assim como bebidas energéticas e bebidas alcoólicas com cafeína, têm estimulado o interesse nos efeitos psicoativos de cafeína (Sheppard et al., 2012).
Os efeitos psicoativos da cafeína compartilham muitas características com a nicotina. Ambas as drogas produzem efeitos subjetivos que são característicos de estimulantes psicomotores (Benwell e Balfour , 1992; Lau e Falk, 1995), no entanto, estes efeitos são moderadas em comparação com estimulantes mais potentes como a anfetamina (Antoniou et ai., 1998; Boye et ai., 2001). Ambas as drogas aumentam a atenção e vigilância (Brunye et al , 2010; Caballero et al , 2011; Vangkilde et al , 2011).
A cafeína é um ingrediente inodoro, incolor e amargo, amplamente utilizado pela população mundial, encontrando-se presente em mais de 60 espécies de plantas no mundo, em uma grande quantidade de bebidas e alimentos, incluindo o café, chá, mate, chimarrão, muitos refrigerantes e chocolate. Pode ser encontrada em medicamentos utilizados para resfriados e alergias, em analgésicos (15 a 64mg/U), moderadores de apetite (50 a 200mg/U) e estimulantes (100 a 200mg/U) (Srisuphan & Bracken, 1986).
A significativa magnitude dos efeitos do café está relacionada com as ações da cafeína, o ativo farmacológico mais conhecido, constituinte do café (Lorist e Tops, 2003). O café é uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo, e milhões de seres humanos bebem todos os dias (Bichler et al., 2007).
O café contém uma variedade de compostos bioativos incluindo derivados de purinas, cafeína e outros polifenóis, incluindo os derivados de ácidos clorogênicos e o produto de sua degradação é o ácido caféico (Bichler et al., 2007).
Além de ter um efeito estimulante sobre o coração e sistema respiratório, a cafeína também apresenta numerosos efeitos comportamentais e estimulantes (Angelucci et al., 2002). A ingestão moderada de cafeína não representa riscos para a saúde. Dews (1984) sugeriu que quando a cafeína é administrada nas doses encontradas em alimentos os seus efeitos são leves e sutis concordando com Smith, 2002 e Tannahill (1989) que consideram a cafeína um estimulante suave quando consumida em doses moderadas. Alguns autores concluem que a rotina do consumo diário de até 1000 mg de cafeína não representa riscos para a saúde humana (Bonita et al., 2007; Glade, 2010). Já outros autores afirmam que a cafeína, mesmo em doses baixas, pode aumentar o tempo de vigília e altas doses de cafeína podem levar a um aumento da ansiedade (Arendash et al., 2006). Arendash et al. (2006) e Angelucci (2002), afirmam que doses moderadas de cafeína induzem comportamentos que sugerem efeitos estimulantes do SNC e nas maiores doses podem suprir a atividade comportamental e até mesmo performances associada ao aprendizado e memória.
A cafeína é um componente importante de chás e o chá é conhecido por conter um elevado nível de antioxidante (Benzie & Szeto, 1999). De acordo com Balansky (1992) o chá verde apresenta propriedades antioxidantes devido a ação genotóxica da cafeína, sendo que o mesmo também pode ser utilizado em cosméticos.
Dentre os diversos estudos realizados em humanos, que procuraram verificar a atividade antioxidante do café, apresentados em duas revisões (Bonita et al., 2007; Dorea e Costa, 2005), destacam-se quatro. Um verificou a presença do antioxidante ácido cafeico, em plasma, 2h após a ingestão de café; outro observou um aumento de 7% na capacidade antioxidante total, que resulta do conjunto de antioxidantes disponíveis no plasma para atuarem como tal; um terceiro verificou um aumento de 16% nos níveis de glutationa, o maior antioxidante in vivo, fundamental para os processos de óxido-redução das células, com a ingestão de cinco xícaras/dia de café estilo moca; e, por fim, um outro estudo observou uma diminuição em 30% da oxidabilidade de LDL, com a ingestão de três xícaras/dia da bebida, indicando uma maior estabilidade desta partícula ao ataque de radicais livres. Estes dados corroboram o efeito protetor do café (Lima, 2010).
O principal alvo molecular dos efeitos psicoestimulantes da cafeína é o antagonismo não-seletivo de adenosina. (Fredholm, 1980; Snyder et al., 1981). A adenosina é um neuromodulador participante na sinalização de muitos neurotransmissores no sistema nervoso central (Cunha, 2001). Quatro subtipos de receptores de adenosina tem sido caracterizados (A1, A2A, A2B e A3), os subtipos A1 e A2A são amplamente expressos no sistema nervoso central e órgãos periféricos. Os receptores de adenosina A1 estão amplamente distribuídos em todo o cérebro, enquanto os receptores A2A estão altamente concentrados no estriado,, núcleo acubens e bulbo olfatório (Fredholm et al., 2005). No entanto, acredita-se que apenas os receptores A1 e A2A têm afinidade suficiente para serem ativados por concentrações fisiológicas de adenosina extracelular, e, portanto, acredita-se que estes subtipos de receptores são os grandes responsáveis pela função neurobiológica da adenosina no cérebro.(Kalda et al 2006).
A cafeína, age nos receptores A1 inibindo os efeitos da adenosina provocando efeitos estimulantes (Hoexter et al., 2005). Nos receptpores A2A a cafeína tem ação antagonista ocasionando aumento da atividade motora pela interação destes receptores com os receptores de dopamina (Fisone et al., 2004).
A cafeína mostra as afinidades para vários tipos de receptores presentes nas membranas sinápticas, e também para fosfodiesterases citoplasmáticos, permitindo a modificação dos mecanismos sinápticos (Yoshimura, 2005). Atua como um antagonista dos receptores da adenosina não seletivo, com o bloqueio dos receptores A2A foi recentemente demonstrado para limitar o efeito sinaptotóxico do precurssor beta amiloide, envolvido na fisiopatologia da doença de Alheimer (Canas et al., 2009) Estudos experimentais em modelos animais demonstraram que os receptores de adenosina A2A e mGlu5R glutamato são co-localizado, e que os efeitos desempenham um papel permissivo na mGlu5R potenciação mediada pelo receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), no hipocampo (Santos et al., 2010).


1.3 Cafeína e envelhecimento

Em humanos, a administração de doses elevadas de cafeína conduz a um aumento dos níveis de ansiedade (Clementz and Dailey, 1988). Do mesmo modo, a administração aguda de altas doses de cafeína promove um comportamento ansioso em diferentes modelos animais, tais como o teste de interação social (Baldwin and File, 1989) ou teste de labirinto em cruz elevado (El Yacoubi et al., 2000). Outros estudos realizados em animais também mostraram que a administração de cafeína provoca frequentemente uma melhoria sobre o desempenho cognitivo, incluindo animais idosos (Higgins et al., 2007; Prediger et al., 2005).
O consumo de café em humanos está associada com uma redução significativa no risco de desenvolvimento de certas doenças crônicas. No entanto, a capacidade de suplementação de café para melhorar a função cognitiva em indivíduos idosos e o efeito dos componentes individuais de café, tais como a cafeína, não têm sido completamente avaliado (Shukitt-Hale et al., 2013).
Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado uma associação negativa entre o consumo de café e doença de Parkinson, outra condição neurodegenerativa importante, particularmente em homens (Ascherio e Chen, 2003). Os mecanismos biológicos plausíveis evocados sugerem que a cafeína pode atenuar a perda de dopamina no estriado e sítios de ligação do transportador de dopamina (Santos et al., 2010). Sonsalla et al., (2012) demonstraram que o tratamento com cafeína protege contra a perda de neurônios da substância nigra em modelos animais com esta doença, mostrando ainda que o tratamento com cafeína foi neuroprotetor, mesmo quando introduzido após o início do processo neurodegenerativo, sugerindo que a cafeína pode ser capaz de retardar a neurodegeneração.
Nos últimos anos, pesquisas sobre o consumo habitual de cafeína têm merecido muita atenção, principalmente em relação aos seus efeitos na melhoria do desempenho cognitivo (Daly, 2007; Ferré, 2008).
Poucos estudos têm testado uma possível associação entre a ingestão de cafeína regular e o risco para a DA. Um pequeno estudo de caso-controle sugeriu que a exposição a cafeína foi significativamente inversamente associado com o risco de Doença de Alzheimer (Maia e Mendonça, 2002). Um estudo prospectivo mostrou também que o consumo regular de café foi associado com um risco reduzido de Alzheimer depois de 5 anos de seguimento. Este estudo avaliou o consumo de café e do chá, mas não foi considerada a quantidade total de ingestão de cafeína, e a associação encontrada pode ter sido parcial devido à exclusão de um grande número de descendentes (Lindsay et al., 2002).
Outros estudos epidemiológicos usaram uma abordagem diferente, avaliar se o consumo de cafeína podem influenciar no declínio cognitivo, com resultados conflitantes (Johnson-Kozlow, et al, 2002; van Gelder et al., 2007). Recentemente, um grande estudo prospectivo epidemiológico com cerca de 7.000 participantes com idades acima de 65 anos, mostrou que as mulheres com altas taxas de consumo de cafeína (mais de três unidades por dia, o que equivale a cerca de 300 mg de cafeína) tiveram menor declínio no desempenho de memória do que as mulheres que consumiram 100mg de cafeína ou menos por dia (Ritchie et al., 2007). O efeito protetor da cafeína aumenta com a idade e não foi observado em homens. No entanto, a incidência da doença de Alzheimer aparentemente não foi diminuída em consumidores de cafeína (Santos et al., 2010).
Porém Espinosa et al., (2013) testaram o impacto da cafeína na demência induzida por Streptozotocina (STZ) e a neurodegeneração do hipocampo bem como sobre a expressão e a densidade de receptores de adenosina em modelo animal. O consumo de cafeína (1 g / L na água de beber, 2 semanas antes de iniciar o desafio STZ) impediu a perda de memória induzida por STZ e a neurodegeneração, assim como a sobre-regulação dos receptores A2A. Estas descobertas fornecem a primeira demonstração de que a cafeína impede a demência esporádica e implicam o controle dos receptores centrais de A2A como o seu mecanismo de ação provável.

1.3.1 As MAPKs (Mitogen activated protein kinase)
O primeiro relato da existência de uma proteína de 42 kDa em diferentes tipos celulares, predominantemente fosforilada no resíduo de tirosina em resposta ao estímulo de fatores de crescimento, se deu em 1983, em um trabalho realizado por Cooper e Hunter. Ao mesmo tempo, serina-treonina quinases ativadas pelo receptor de insulina (IRK), que possui atividade tirosina quinase, estavam sendo caracterizadas, sob a hipótese de que a fosforilação do resíduo de tirosina iria regular a atividade dessas quinases (Ray e Sturgill, 1988; Anderson et al., 1990).
Ray e Sturgill (1988) também demonstraram que a serina-treonina quinase de 42 kDa isolada de células 3T3-L1 estimuladas com insulina, chamada de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), sofria fosforilação nos resíduos de treonina e tirosina. Logo se percebeu que esta proteína era a mesma que respondia aos fatores de crescimento e que a fosforilação de ambos os resíduos era necessária para a ativação de MAPKs (Rossomando et al., 1989).
Boulton e colaboradores (1990) isolaram o cDNA desta proteína e a renomearam ERK1 (quinase regulada por sinal extracelular 1) devido à variedade de fatores extracelulares capazes de estimularem-na. O isolamento do cDNA das proteínas ERK2 e ERK3 se deu logo em seguida por Boulton e colaboradores (1991) e permitiu concluir que a seqüência destas proteínas era muito próxima àquela observada nas proteínas Kss1p e Fus3p da Saccharomyces cerevisiae, demonstrando uma estreita homologia entre as MAPKs de mamíferos e de leveduras.
O conceito de que havia múltiplas MAPKs com distintas funções e regulação surgiu com a descrição de outras vias encontradas inicialmente em leveduras, como a das proteínas HOG1 e MPK1, seguida pela descoberta em metazoários da proteína quinase c-jun-N-terminal / proteína quinase ativada por estresse (JNK/SAPK), enzimas p38 e outras (Brewster et al., 1993; Han et al., 1994; Kyriakis et al., 1994; Dérijard et al., 1994).
Seis grupos principais de MAPKs foram caracterizados em mamíferos: a proteína quinase regulada por sinal extracelular (extracellular signal-regulated kinase) ERK1/2, ERK7/8, ERK3/4 e ERK5 (também conhecida como big map kinase1, BMK1); a JNK (c- Jun N-terminal kinase) JNK1/2/3 e a p38 (p38α/β/γ/δ). As proteínas mais estudadas são ERK1/2, ERK5, JNK e p38, sendo que há pouca informação disponível na literatura sobre as ERKs 7/8 e 3/4 (Krishna e Narang, 2008).
Estas proteínas sinalizadoras são responsáveis pelo recrutamento de outras proteínas sinalizadoras que, em conjunto, permitem a transmissão de informações acerca do meio extracelular para o núcleo da célula, onde determinam alterações na taxa de transcrição de genes específicos e a ativação de fatores de transcrição (Johnson e Lapadat, 2002).

1.3.2 Vias de sinalização das MAPKs
As vias de sinalização envolvendo MAPKs são ativadas em resposta a uma ampla variedade de estímulos, incluindo hormônios (por exemplo, insulina e melatonina), fatores de crescimento (por exemplo, PDGF, EGF e neurotrofinas), diversas citocinas inflamatórias e outros estímulos físicos ou químicos (por exemplo, radiação, choque osmótico, isquemia e trauma). Estes estímulos atuam através de diferentes famílias de receptores, como receptores acoplados a proteínas G (GPCR), receptores tirosina quinase, receptores de citocinas e receptores serina- treonina quinase. As MAPKs coordenam diversas funções, como transcrição de genes, síntese protéica, ciclo celular, proliferação, diferenciação e morte celular. Seus alvos podem incluir outras proteínas quinases, fosfolipases, fatores de transcrição ou proteínas do citoesqueleto (Johnson e Lapadat, 2002; Krishna e Narang, 2008).
As MAPKs são reguladas por cascatas de fosforilação, estabelecendo uma via de ativação seqüencial composta de, no mínimo, três proteínas. A transmissão de sinais através destas cascatas é normalmente iniciada pela ativação de uma pequena proteína G, como a Ras, ou pela interação e ativação de componentes superiores da cascata com proteínas adaptadoras. Então, os sinais são passados ao longo da via, por proteínas quinases citosólicas, organizadas em três a cinco níveis. As quinases de cada nível fosforilam e ativam quinases localizadas abaixo, permitindo uma transmissão controlada e rápida dos sinais para vários alvos nas cascatas. Três dessas proteínas, MAPK quinase quinase (MKKK, também chamada MAP3K ou MEKK), MAPK quinase (MKK ou MAP2K) e MAPKs, são consideradas principais. Já a proteína superior, MAPK quinase quinase quinase (MKKKK ou MAP4K), e a inferior, proteína quinase ativada por MAPKs (MKs ou MAPKAPK), não são indispensáveis para essa cascata de sinalização. Uma vez ativadas, as MAPKs fosforilam resíduos de serina e treonina em seus alvos específicos, nos casos em que estes aminoácidos forem seguidos por uma prolina (Johnson e Lapadat, 2002; Krishna e Narang, 2008).
Cabe ressaltar que cada um dos níveis das diferentes cascatas é constituído por diversos componentes formados por produtos de genes distintos, e são frequentemente traduzidos para várias isoformas alternativas. Cerca de 70 genes são conhecidos atualmente como codificadores para, aproximadamente, 200 componentes que formam toda a via das MAPKs. Esta multiplicidade de componentes permite uma regulação e especificidade rigorosas, características importantes dessa via de sinalização (Keshet e Seger, 2010).

1.3.3 Proteína quinase ativada por sinal extracelular – ERK1/2
As duas isoformas ERK1 e ERK2, também chamadas p42 e p44, possuem 83% de identidade entre os seus aminoácidos e são amplamente expressas em todos os tecidos, incluindo em células diferenciadas. Ambas isoformas estão envolvidas na regulação da meiose e mitose, além de exercerem funções pós-mitóticas em células diferenciadas, e são ativadas por fatores de crescimento, citocinas, infecções virais, carcinógenos, estresse osmótico, entre outros (Rubinfeld e Seger, 2005).
A via das ERKs é constituída pelas proteínas MAPKKKs A-Raf, B-Raf e Raf-1, as MAPKKs MEK1 e MEK2, além das ERKs 1 e 2 (Roux e Blenis, 2004). A ativação desta via ocorre quando estímulos extracelulares provocam um aumento na forma ativa da Ras, uma proteína ligante de GTP. O complexo Ras- GTP ativa então a próxima proteína, Raf, que acaba por fosforilar as proteínas MEKs, cujo papel é ativar ERK1 e ERK2. Depois de ativadas, essas proteínas fosforilam diversos substratos em todos os compartimentos celulares, incluindo proteínas na membrana, substratos nucleares e proteínas do citoesqueleto, além de outras quinases (Thomas e Huganir, 2004).
A sinalização pelas proteínas ERK está envolvida com vários mecanismos, como a proliferação celular, dessa maneira implicando sua ação na carcinogênese, além de exercer papel na apoptose, ciclo celular, desenvolvimento e diferenciação celular (Krishna e Narang, 2008).
Além disso, sabe-se que a ERK também pode ser ativada nos neurônios em resposta à sinalização glutamatérgica excitatória, sendo capaz de controlar diversas formas de plasticidade sináptica cerebrais envolvidas em processos de aprendizado e memória (Adams e Sweatt, 2002).

1.3.4. Proteína quinase p38 MAPK
Existem quatro isoformas das proteínas p38 MAPKs: α, β, γ e δ. Estímulos químicos e físicos, como estresse oxidativo, radiação, hipóxia e citocinas inflamatórias desencadeiam a ativação de várias MAPKKKs dando início à via de sinalização das proteínas p38. Essas MAPKKKs ativam as proteínas MEK 3 e MEK 6 que ativam apenas p38, sem influenciar a ERK ou a JNK. Enquanto a MEK 6 é capaz de ativar todas as isoformas de p38, a MEK 3 fosforila preferencialmente as isoformas α e β (Enslen et al., 2000).
O papel da p38 no processo inflamatório tem sido amplamente estudado, uma vez que esta via está envolvida em respostas funcionais de macrófagos e neutrófilos, como quimiotaxia, exocitose granular, aderência e apoptose, bem como na diferenciação de células T (Dong et al., 2002; Cook et al., 2007). Seus alvos principais incluem fatores de transcrição, MKs e proteínas citosólicas (Krishna e Narang, 2008).

1.3.5 Proteína quinase c-jun-NH2-terminal – JNK
As proteínas JNK foram originalmente descritas como proteínas quinases ativadas por estresse (SAPKs), sendo renomeadas para enfatizar seu papel na fosforilação e ativação do fator de transcrição c- jun. As isoformas JNK1 e JNK2 são expressas em todos os tecidos, enquanto a JNK3 é restrita ao cérebro, coração e testículos. Essas isoformas podem ser ativadas em resposta aos mais variados estímulos, como citocinas, radiação UV, fatores de crescimento e trauma (Johnson e Lapadat, 2002; Krishna e Narang, 2008).
A regulação da via destas proteínas é complexa, uma vez que envolve 13 MAPKKKs. A sinalização inicia com as proteínas MAPKK4 e MAPKK7, que podem ser ativadas por uma grande variedade de fatores, incluindo as MAPKKKs, MEKK1-4, MLK2 e 3, ASK1/2, entre outras. Diferentes MAPKKKs são específicas para diferentes estímulos, como a TAK1 que parece responder a algumas citocinas inflamatórias como IL- 1β e TNF-α (Kyriakis e Avruch, 2001). Dessa forma, a ativação prolongada da JNK pode influenciar mecanismos celulares importantes como a morte celular e a proliferação celular alterada (Liu e Lin, 2005), enquanto que a sua ativação transitória parece promover a sobrevivência celular (Ventura et al., 2006).
Os alvos da proteína JNK incluem fatores de transcrição e receptores hormonais nucleares, embora o seu alvo nuclear mais conhecido seja o fator c-jun. Proteínas adaptadoras não nucleares e mitocondriais, como aquelas envolvidas na apoptose, também servem de substrato para essas proteínas (Balbi et al., 2009).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a sinalização de MAPKs em tecido neural de camundongos velhos tratados com cafeína.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1. Avaliar a sinalização neural de ERK 1/2; JNK, P38 em camundongos velhos tratados com cafeína e grupo controle.

2.2.2. Correlacionar os resultados obtidos através de dois testes, de forma a fornecer maior segurança em relação aos resultados e da indicação dos efeitos da cafeína sobre o envelhecimento.

3 MÉTODOS

3.1 Animais

Serão utilizados 40 camundongos albinos Swiss machos (30 - 40g), divididos em adultos-jovens (3-4 meses de idade) e adultos-velhos (10-14 meses de idade), os animais serão obtidos do biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense. Os camundongos serão alojados em caixas de polietileno, com comida e água ad libitum.e serão mantidos em um ciclo de 12 horas luz-escuro (a luz é ligada às 7h da manhã), com temperatura controlada de 22±1ºC. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNESC com o protocolo número 103/2012 e os experimentos serão conduzidos de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA.,

3.2 Amostra

Os animais serão divididos em 4 grupos:
Grupo 1: controle: adultos -jovens que receberão água (n= 10)
Grupo 2: adultos jovens que receberão cafeína (n=10)
Grupo 3: controle: adultos velhos que receberão água (n=10)
Grupo 4: adultos velhos que receberão cafeína.(n=10)
O número total de animais foi previsto de acordo com a possibilidade de morte natural destes animais devido a idade.




3.3 Tratamento com cafeína

Durante quatro semanas os camundongos tratados receberão solução de cafeína (0,3 g/L) na garrafa de água como única bebida disponível. A solução de cafeína será trocada a cada 48 horas para uma solução fresca. A dose de cafeína utilizada é considerada proporcional a 1 xícara de chá de café/dia para homens (Da Silva et al., 2005). O volume de água ou cafeína consumido será quantificado e dividido por quatro (número de animais na gaiola).
Após o tratamento os animais sofrerão eutanásia por deslocamento cervical para a retirada do hipocampo, para a realização do Wetern blotting.

3.4 Testes utilizados

Será realizado o Western blotting utilizando parte do hipocampo, ao final do tratamento.


3.4.1 Western blotting

3.4.1.1 Separação de Proteínas por Eletroforese (SDS-PAGE)

Após os procedimentos experimentais os hipocampos dos animais serão armazenados em freezer -80 para conservação do material para posterior procedimento.
As amostras serão solubilizadas em tampão de amostra composto por duodecil sulfato de sódio (SDS) 4%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 5mM e β-mercaptoetanol 8 %, pH 6,8; e diluídas em solução de diluição: 40 % de glicerol, 25 mM de Tris-HCl e azul de bromofenol pH 6,8. As proteínas serão preparadas por SDS (30 µg/poço) usando gel de separação com gradiente de acrilamida. A concentração da acrilamida no gel de separação será de 7,5%. O gel de entrada de concentração 4% de acrilamida (Laemmli, 1970). A eletroforese será realizada com corrente fixa de 40 mA e voltagem máxima de 140 mV (para 2 géis), por aproximadamente 2 horas. Após a corrida os géis serão submetidos a eletrotransferência em tampão Tris-HCl mM, glicina 140 mM e metanol 10 % por 1 hora, em corrente de no máximo 100mA e voltagem de 350 mV a 4°C, para transferência das proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose de 0,4 µm de porosidade.

3.4.1.2 Imunodetecção de proteínas

Após a eletrotransferência, as membranas serão bloqueadas (15 minutos) com gelatina de peixe 0,5% em TBS-T (Tween-20 0,05%, Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e a seguir lavadas com TBS-T (Collins e Sim, 1998). As membranas serão incubadas com anticorpos primários contra as proteínas JNK, ERK e p53, todas nas forma total e fosforilada, em concentrações testadas previamente, por 12 -14 horas (overnight). Para detecção dos complexos imunes, as membranas serão novamente lavadas com TBS-T e os respectivos anticorpos secundários (ligados a peroxidase) serão incubados. Após lavagens com TBS-T a imunodetecção será revelada por emissão de quimioluminescência com reagentes luminescentes (Pierce) seguindo as recomendações do fabricante, e impressão de imagem em filme auto-radiográfico. As imagens serão visualizadas em software para quantificação densitométrica das bandas protéicas (Scion Image, Beta 4.0.2; Scion Corporation).

3.4.1.3 Dosagem de proteína

As proteínas serão dosadas através do método de Peterson, descrito brevemente a seguir. Sobre alíquotas de 2 μl das amostras serão adicionados 398 mL de água e 400 mL do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH; 2,5% de SDS; 5% de Na2CO3; 0,2% de CuSO4 e 0,1% de tartarato duplo de Na+/K+). As amostras serão homogeneizadas imediatamente e deixadas para reagir por dez minutos. Em seguida será adicionado 200 mL do reagente de Folin 0,4 N seguido de homogeinização e incubação por 30 minutos. A leitura do complexo de cor será realizada em espectrofotômetro (comprimento de onda de 750 nm) e as concentrações proteicas serão obtidas a partir uma curva padrão utilizando albumina de soro bovino (BSA; 0,1 mg/mL).

3.5 Análise estatística

A normalidade das variáveis será avaliada pelo teste Kolmogorov-Smirnov. As análises estatísticas para Índice de Dano, Frequência de Dano e imunoconteúdo de proteínas serão feitas através de análise de variância de uma via (ANOVA) e quando o teste apresentar diferença entre os grupos será aplicado o teste post-hoc de Tukey. Em caso de dados não-paramétricos será utilizado o teste Kruskal-Wallis usando o teste Dunn como post hoc. Uma diferença de P < 0.05 será considerada estatisticamente significante. O pacote estatístico utilizado será o BioEstat 5.0.


3.6 Critérios de suspensão ou encerramento de pesquisa:

Todos os equipamentos, reagentes e drogas necessárias para a realização deste projeto estão disponíveis ao proponente, corroborando com isto, não há riscos de vida para os animais, com isso, não há critérios aparentes para suspensão ou encerramento da pesquisa. Ainda assim, os animais serão monitorados diariamente quanto ao seu estado de saúde. A suspensão ou encerramento da pesquisa serão realizados quando o pesquisador responsável julgar necessário após observar alterações significativas dos parâmetros abaixo desde que tais alterações ponham em risco a vida do animal: comportamento motor e alimentar, cor, quantidade e consistência do bolo fecal, estado geral de conservação da pele e dos pêlos bem como suas colorações, padrão da freqüência respiratória, peso e temperatura corporais.

3.7 Critérios de inclusão e exclusão:

Serão incluídos apenas camundongos Swiss machos com totais condições físicas. Serão excluídos os animais que morrerem durante o experimento de quaisquer que sejam os grupos de tratamento. A presença de animais nos grupos que receberão dieta cafeteira abaixo do peso corporal da média do grupo serão consideradas para a exclusão do projeto de pesquisa. Neste caso, será realizada a eutanásia dos animais por deslocamento cervical.

3.8 Local de realização da pesquisa:

A pesquisa será realizada na Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), no Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LABIM), localizado no Bloco S, sala 22, um dos laboratórios do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Dispõe de infra-estrutura e de equipamentos necessários para as atividades de ,biologia molecular e análises toxicogenéticas.


3.9 Infra-estrutura:

Todos os envolvidos no projeto utilizarão todos os equipamentos de proteção individual (EPI) que sejam necessários para cada procedimento. Os procedimentos experimentais serão realizados de acordo com as recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UNESC com o protocolo número 103/2012 e os experimentos serão conduzidos de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA

3.10 Procedimentos para minimizar sofrimento/risco do animal:

Será evitado qualquer procedimento que possa colocar o animal em risco ou sofrimento. Sendo assim, todos estes serão de acordo com as normas do comitê de ética. Destino dos animais pós-experimentação: O descarte dos animais utilizados neste experimento será o acondicionamento em saco branco leitoso e encaminhados para freezer (conservação) na universidade. Após conservação, serão coletados e transportados por empresa terceirizada. Os resíduos são tratados fisicamente e posteriormente encaminhados para disposição final em aterro sanitário. Todos os procedimentos são conforme RDC nº 306/2004 da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária).
































4 CRONOGRAMA

Períodos/





20122012
2012
2012










20132013
2013
2013






Atividades
F
M
A
M
J
J
A
S
O
N
D
J
F
M
A
M
J
J
A
S
O
N
D
Revisão da literatura






X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Avaliação pelo ceua da unesc






X
















Tratamento dos animais e coleta de material






X
X




X
X









Western blotting







X
X





X
X







Análise estatística dos resultados











X



X







Redação de artigo científico













X
X
X
X
X
X
X
X
X

Entrega do trabalho






















X











5 ORÇAMENTO
Discriminação
Quantidade
Valor Unitário R$
Valor Total R$
1. Material de Consumo



anticorpos primários contra as proteínas JNK (total e fosforilada).
1
1.100,00
1.100,00
anticorpos primários contra as proteínas ERK (total e fosforilada).
1
1.100,00
1.100,00
anticorpos primários contra as proteínas P38 (total e fosforilada).
1
1.100,00
1.100,00
Blotting Membranes Hybond ECL (Amersham Bio)
1
1.400,00
1.400,00
Lâmina lapidada p/ microscopia ponta fosca 26x76mm
20
5,80
116,00
Ácido Acético Glacial- Nuclear
1
13,00
26,00
Ácido clorídrico –Merck
1
248,70
248,70
Ácido Tricloroacético 500g- Nuclear
1
75,00
75,00
Ácido Tungstosilicico 50g -Sigma Aldrich
1
407,00
407,00
Carbonato de Sódio 1kg –Quimex
2
15,50
31,00
Cloreto de Potássio 1kg- Nuclear
2
14,00
28,00
Cloreto de Sódio 1kg – Quimex
4
8,30
33,20
Dimetilsulfoxido 1L – Nuclear
3
34,00
102,00
EDTA Sal Dissodico 1L – Nuclear
4
43,70
174,80
Etanol 1L – Nuclear
1
9,50
9,50
Formaldeído 1L – Quimex
2
11,97
23,74
Fosfato de Sódio Dibásico 1kg- Nuclear
2
16,60
33,20
Fosfato de Sódio Monobásico 1kg- Nuclear
1
32,00
32,00
Glicerina Bidestilada (Glicerol) 1L – Nuclear
2
22,00
44,00
Hidróxido de Sódio 500g – Quimex
6
8,30
49,80
Metil Metano sulfonato (MMS) Sigma
1
554,00
554,00
Nitrato de Amônia 1kg – Quimex
2
44,50
89,00
Nitrato de Prata 100g – Quimex
1
261,40
261,40
Sulfato de Zinco – heptaidratado 1kg – Invitrogen
2
23,04
46,08
Tris Hidroximetil 1kg – Invitrogen
2
280,00
560,00
Triton X-100 1L – Nuclear
2
108,50
217,00
Cafeína 500 gramas
1
550,00
550,00
Camundongos Swiss
40
12,00
480
Total


7.791,42


7. FONTE FINANCIADORA
Todas as despesas necessárias para o desenvolvimento do projeto serão subsidiadas pelo Laboratório de Biologia Celular e Molecular com financiamento do CNPq e UNESC.
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