Repelência e Toxicidade de Extratos de Croton floribundus Spreng. em Saúvas da Espécie Atta sexdens rubropilosa L. (Hymenoptera: Formicidae);

Repelência e Toxicidade de Extratos de Croton floribundus Spreng. em Saúvas da Espécie Atta sexdens rubropilosa L. (Hymenoptera: Formicidae) Edegar Bernardes Silva¹ ¹ Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Laboratório de Fitoquímica, Rua do Matão, Rua do Matão, 277 - CEP 05508-090, São Paulo - SP

INTRODUÇÃO As saúvas, do gênero Atta, são um grupo de formigas pertencentes à Tribo Attini (Fig. 1), as quais têm como característica o cultivo de fungos em seu ninho (Hölldobler & Wilson, 1990). Dentro desta tribo, há um grupo monofilético conhecido por ‘formigas cortadeiras’, cujos indivíduos são encontrados na região Neotropical, Norte do México e Sul dos Estados Unidos (Guénard et al., 2010), e que contém dois gêneros: Acromyrmex (quenquéns) e Atta (Saúvas). Como o próprio nome diz, esse grupo tem como característica cortar folhas e flores frescas (Richard et al., 2005) e levá-lo como alimento para o fungo simbionte da família Lepiotaceae (Agaricales: Basidiomycota) (Chapela et al., 1994). Desta maneira, tal caractística conferiu a esse grupo o título de “principais “herbívoros”” da região Neotropical, com capacidade para cortar cerca de 17% da vegetação dessas regiões (Tanigushi, 2007).

Figura 1 - Filogenia da Tribo Attini. Fonte: tolweb.org

Em paisagens modificadas pelo homem, o comportamento de forrageio dessas formigas não é diferente, havendo o corte de plantas em áreas de florestamento, nas quais os maiores problemas ocorrem com espécies dos gêneros Pinus e Eucalyptus (Boaretto & Forti, 1997). Amante (1972), por exemplo, calcula que uma densidade de 4 ninhos/ha de A. sexdens rubropilosa foi responsável pelo prejuízo de 14% das plantações de Eucalyptus sp. e 14,5% para a produção de Pinus sp. Além disso, também há problemas econômicos decorrente do ataque a plantas na agricultura (cana-de-açúcar, manga, algodão, café, laranja e outros cítricos etc – Mariconi, 1970) e em pastagens (Amante, 1967). Diante dos problemas econômicos causados pelas formigas cortadeiras, elas são alvos de diferentes tipos de controle, dentre os quais se pode citar o mecânico, o físico, o biológico, o químico e o cultural, cada qual com suas vantagens e desvantagens, resumidas na Tabela 1. Assim, a busca por componentes naturais que não apresentem toxicidade ao ambiente, apresentem viabilidade econônomica e viabilidade operacional ao agricultor (Roel, 2001) e que sejam tóxicos à formiga e/ou ao fungo simbionte e somente contra eles, torna-se uma alternativa a ser investigada e aplicada. Na literatura, são encontrados diversos trabalhos que utilizam algumas classes de metabólitos vegetais com potencial efeito tóxico às formigas. Biavatti et al.(2005), por exemplo, verificaram, contra A. sexdens rubropilosa, alta toxicidade do ácido limonéxico extraído do caule de Raulinoa echinata Cowan (Rutacea). Já Viegas Jr. (2003) analisou o uso de terpenoides superiores com atividade inseticida em Formica rufa L. Outros trabalhos se concentram na busca de compostos tóxicos ao fungo simbionte como alvo alternativo à extinção dos ninhos. Neste contexto, Miyashira (2007) observou ação tóxica contra o fungo simbionte de concentrações maiores que 0,05% de cafeína, um alcaloide, e Tanigushi (2007) verificou que a sinigrina, um glicosinolato, ao se degradar em autoclave, tinha alta toxicidade contra o fungo simbionte.

TABELA 1 - Vantagens e Desvantagens de Controles de Formigas Cortadeiras Tipo de controle

Mecânico

Físico

Biológico

Químico

Cultural

Descrição

Vantagens

Desvantagens

Referência

com

Atinge diretamente a rainha, matando todo o formigueiro

Aplicado somente a formigueiros com menos de 4 meses de fundação. Após, torna-se difícil encontrar a panela da rainha

Forti & Boareto, 1997 apud Oliveira, 2006, p. 12

Utilização de obstáculos para evitar que as formigas cortadeiras atinjam as folhagens das árvores

Recomendado para áreas pequenas como canteiros, áreas urbanas, pequenos viveiros

Inviável para áreas muito grandes diante da aplicabilidade operacional

Anjos et al., 1998 apud Oliveira, 2006, p. 12

Utilização de inimigos naturais, visando o seu controle. Pode ser feito pela conservação de ambientes com a presença de inimigos naturais ou pela introdução destes

Controle natural das formigas cortadeiras

Há necessidade de estudos mais efetivos sobre as estratégias de controle e a sua aplicabilidade

Mariconi, 1970

É a ação de produtos químicos por meio de diversas estratégias de aplicação: fumigantes, pósquímicos, iscas granuladas, termonebulização, nebulização.

De modo geral, são eficientes, causando mortalidade rápida do formigueiro.

Muitos métodos apresentam desvantagens econômicas e operacionais. Além disso, algumas substâncias são muito tóxicas tanto ao aplicador como para o ambiente.

Della Lucia & Vilela, 1993; Forti & Boareto, 1997; Anjos et al., 1998 apud Oliveira, 2006, p. 12

Aração e gradagem do solo para eliminação mecânica do formigueiro. Também se pode utilizar culturas armadilha ao redor da cultura principal.

Há grandes possibilidades de que a lâmina de aração atinja a panela da rainha.

Somente recomendável para formigueiros com menos de 4 meses de fundação ou que tenha atingido no máximo 20 cm de profundidade.

Della Lucia & Vilela, 1993; Forti & Boareto, 1997 apud Oliveira, 2006, p. 12

Destruição do enxadas e pás

formigueiro

Já verificou-se que espécies do gênero Croton (Euphorbiaceae) possuem metabólitos vegetais que inibem a ação de herbívoros (Llandres, Rodríguez-Gironés & Dirzo, 2010; Boege, 2004; Oliveira & Freitas, 2004). C. floribundus, uma espécie pioneira com ampla distribuição no Brasil (Cordeiro, 1985 apud Paoli et al., 1995, p. 2), já apresentou em Medina et al. (2009) ação tóxica contra moluscos

e contra as cercárias de Schistosoma mansoni

Samson,1907. No entanto, a toxicidade do extrato de C. floribundus nunca foi testada em A. sexdens rubropilosa. Apesar de não haver no trabalho de Falcão (2004) indícios de repelência de C. floribundos em A. cephalotes, Garcia et al. (2003) verificaram que esta planta é pouco ou quase nada cortada por A. sexdens rubropilosa, sendo observado apenas um registro de corte, justamente

no período de seca, o qual está associado a menor seletividade das formigas, segundo o estudo. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar a toxicidade e repelência de extratos brutos de C. floribundus em indivíduos da espécie A. sexdens rubropilosa.

MATERIAL E MÉTODOS Para indetificar a toxicidade e repelência em A. sexdens rubropilosa, dois bioensaios foram realizados: um bioensaio de toxicicidade e outro, de repelência. Para ambos os testes, foram realizados em sequência os extratos hexânico, diclorometânico e metanólico de 10 g de folhas de C. floribundus previamente trituradas em nitrogênio. Os 3 extratos gerados foram secos em estufa e, em seguida, concentrados a 10 e 50 µg/ml cada um. Em seguida, foram realizados os preparos, separadamente, para cada bioensaio: Toxicidade - O ensaio tópico de toxicidade foi realizado com indivíduos de 3 formigueiros (n=3) do Laboratório de Fitoquímica do IB/USP, os quais foram selecionados aleatoriamente, respeitando-se o intervalo de 2,0 a 3,5 mm de largura da cápsula cefálica. Tal intervalo segue as categorias 1 e 2 para formigas da espécie Atta vollenweideri Forel 1893, levantadas por (Simas et al., 2002). Em um ensaio prévio a esse, demonstrou-se que não há relação estatística entre o tempo de sobrevivência dos indivíduos e o tamanho da cápsula cefálica dentro do intervalo estipulado. Todos os formigueiros de onde foram retirados os indivíduos foram alimentados com folhas de Acalypha wilkesiana Mull. Arg (Euphorbiaceae), em dias alternados, durante duas semanas anteriores ao bioensaio. De cada formigueiro foram retirados 12 indivíduos

para

cada

tratamento

testado

(Hexano10,

Hexano50,

Diclorometano10, Diclorometano50, Metanol10, Metanol50),12 indivíduos para o controle de cada solvente (Hexano, Diclorometano e Metanol) e 12 formigas para o controle seco, totalizando 120 formigas por formigueiro ou 360 formigas no total. Foram aplicados nos indivíduos selecionados 2 µL dos respectivos tratamentos e controles na região do pronoto (Fig. 2), por meio de um micropipetador.

Figura 2 - Esquema de formiga na região dorsal mostrando a região do pronoto. Adaptado de Fernández (2003).

Após a aplicação, todas as replicatas foram mantidas em placas de petri (aprox. 10 x 1,5 cm) contendo 6 formigas por placa, além de conterem algodão embebido em água e a dieta sólida adaptada de Bueno (1997). Essa dieta foi colocada em pequenas tampas, formando uma camada de aprox. 0,5mm de espessura, sendo reposta num intervalo de 48 horas para evitar a ação de fungos. Além da dieta, o algodão também era reposto no mesmo intervalo. A Figura 3 mostra o detalhe da placa montada e a Figura 4 elucida o layout do bioensaio:

Figura 3 - Placa montada para o bioensaio. Fonte: Tanigushi (2007)

Figura 4 - Disposição das placlas de petri para bioensaio de toxicidade.

Para a obtenção dos dados, foi medida a quantidade de formigas mortas diariamente em cada uma das placas até que restasse 5% de indivíduos vivos. Em seguida, foram feitas curvas de sobrevivência e foi aplicado o teste log-rank a 10% e 50% de sobrevivência a fim de verificar diferenças significativas nas mortes dos tratamentos em dois períodos diferentes. Repelência – Neste ensaio, foram aplicados 2 µL dos respectivos tratamentos e controles em papeis filtro em forma de disco (diam. = 5 mm). Em seguida, esses discos foram deixados em capela durante 5 minutos para a evaporação dos solventes. Em seguida, o desenho do bioensaio foi montado, o qual consistia em um formigueiro ligado a um recipiente (panela) através de uma mangueira, a qual era interrompida por um registro para controle de fluxo de formigas (Fig. 5). Era necessário controlar o fluxo de formigas para evitar o que é conhecido por rejeição tardia (Herz et al., 2008; Saverschek et al., 2010), que consiste em o fungo simbionte sinalizar às formigas para pararem de cortar aquele substrato caso ele seja tóxico ao próprio fungo.

Figura 5 - Layout do bioensaio.

Os testes foram feitos separadamente para cada extrato. Desta forma, havia quatro opções de forrageio pela formiga. São eles: Controle Seco (CS), Controle com respectivo solvente (CS), Tratamento 10 µm/ml (T10) e Tratamento 50 µm/ml (T50). As condições dentro do laboratório eram controladas com temperatura entre 24 e 25 ºC e umidade relativa do ar entre 60 e 70 %. Para o teste no recipiente, os discos eram dispostos aleatoriamente em uma das quatro posições, em raio, a partir da saída da mangueira (Fig. 6). Em um teste prévio com discos de Acalipha sp. (diam. = 5 mm), viu-se que, estatisticamente, por meio do teste de qui-quadrado, a chance de a formiga escolher qualquer um dos discos nas 4 posições é a mesma com essa disposição de forma equidistante. Após a disposição dos discos, libera-se a passagem de apenas uma formiga por meio da abertura do registro. Em seguida, é anotado o comportamento da formiga diante da sua

escolha.

A anotação

do

comportamento só é feita quando o indivíduo tateia, com as antenas, o primeiro disco “escolhido”. Desta forma, se não houvesse essa interação entre o

substrato e a formiga, a observação do comportamento não era interrompida com aquele indivíduo.

Figura 6 - Esquema dentro do recipiente para forrageio das formigas. Exemplo com extrato metanólico (CM - Controle Metanol). Note que a distância de entre os discos e a saída da mangueira é igual.

Ao interagir com um dos discos e o comportamento ser anotado, o indivíduo era isolado do formigueiro para evitar a possível transmissão de informações aos outros indivíduos do ninho. Em seguida, o papel filtro maior, da base do recipiente, era trocado para evitar a troca de informações entre as formigas por meio de suas trilhas de hormônio, o que foi verificado em um teste prévio com discos de Acalipha sp. (diam. = 5 mm) com e sem o papel filtro da base: quando não havia troca de papel da base, mostrou-se, por meio do teste qui-quadrado, que não havia aleatoriedade entre as posições, ocorrendo inclusive, um viés de uma das posições, provavelmente pelo fato de as formigas subsequentes estarem seguindo a trilha de hormônio das formigas anteriores. Por fim, após troca do filtro da base, o teste era reiniciado com outro indivíduo, totalizando uma amostra de 52 indivíduos (N = 52).

Assim, ao evitar a transmissão de informações entre os indivíduos com o seu isolamento, o contanto entre eles por meio do fechamento do registro e a transmissão de informação por meio das trilhas de hormônio, garante-se que os dados da variável ‘comportamento’ é independente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Toxicidade - Os resultados obtidos nos testes de sobrevivência realizados com os diferentes extratos (C4H16, CH2Cl2 e MeOH) podem ser observados

nas

curvas

de

sobrevivência

construídas

com

base

porcentagem de sobreviventes ao longo do tempo (Fig. 7).

Figura 7 - Curvas de sobrevivência de populações de A. sexdens rubropilosa submetidas aos diferentes tratamentos: CS=controle seco, CH=controle com hexano, TH10=tratamento com extrato hexânico a 10µg/ml, TH50= tratamento com extrato hexânico a 50µg/ml. As mesmas legendas se aplicam aos outros extratos (D = Diclorometano; M = Metanol).

na

Não se observou pelo teste log-rank diferenças significativas entre as curvas dos controles e as dos tratamentos para todos os extratos. No entanto, observa-se que as populações submetidas aos controles apresentaram uma queda mais rápida do número de sobreviventes ao longo do tempo. Desta forma, os extratos estariam exercendo uma ação no sentido de aumentar a longevidade das formigas, efeito inverso ao que era esperado. Além disso, o controle de hexano levou a uma alta taxa de mortalidade nos momentos iniciais (primeiras 24h), o que permite afirmar que o padrão similar observado nos tratamentos hexânicos (TH10 e TH50) deve-se à ação do solvente neste caso e não das substâncias extraídas da planta, pois, novamente, quanto maior a concentração do extrato, menor a quantidade de formigas mortas em relação ao controle hexânico. Tais dados revelam a ineficácia deste tipo de bioensaio para testar a toxicidade, já que muitas vezes o efeito do solvente é o fator limitante, independente das concentrações utilizadas, e a ação da substância ou do extrato em questão não pode ser testada. Outros trabalhos apresentam o mesmo problema, corroborando o fato de que o método, amplamente utilizado em diversos trabalhos (Oliveira, 2006; Miyashira, 2007; Alonso, 2010; Biavatti et al., 2005, Bueno, 1997), é passível de ser aperfeiçoado. Em trabalho de Oliveira (2006), por exemplo, verifica-se que não há diferenças significativas entre os controles e o tratamento, com situação muito similar aos resultados deste trabalho, pois o controle seco possui mortalidade maior que os outros tratamentos e o controle solvente com 50% de sobreviventes de A. sexdens rubropilosa (Fig. 8). Figura 8 - Curvas de sobrevivência de operárias de Atta sexdens rubropillosa, submetidas ao tratamento tópico com o óleo bruto de Azadirachta indica em diferentes concentrações. Notar maior mortalidade de controle (dieta pura) no 10º dia. Fonte: Oliveira (2006)

Cabe ressaltar também que há limitações neste bioensaio com relação ao número amostral, pois é necessário uma grande quantidade de formigueiros para obter um desvio-padrão aceitável e, assim, obter dados mais consistentes para serem discutidos, o que nem sempre é possível diante das limitações de espaço e cuidado com esse tipo de organismo. Repelência - Nos experimentos de repelência puderam ser observados diferentes comportamentos, por parte das formigas frente aos discos de papel filtro, passivos de algumas interpretações. Cada comportamento foi associado a uma cor distinta: 

Carregar (verde), indicando que não há repelência;



Carregar e soltar (vermelho) ou somente tatear (azul), ambos sugerindo que não há repelência, embora isso não possa ser afirmado com certeza uma vez que possa ser reflexo apenas de uma falta de interesse;



Tatear e se limpar (amarelo), indicando repelência.

Para efeitos de comparação, apenas os comportamentos de carregar e de tatear e se limpar serão considerado, uma vez que os outros não indicam com certeza a presença ou ausência de repelência. Os resultados da quantidade de vezes que cada comportamento foi observado para cada tratamento foram computados e podem ser vistos na Figura 9. Os discos de papel usados como controles foram apenas tateados ou, na maior parte das vezes, ignorados, indicando que qualquer efeito de atração ou repelência não tem relação com o disco em si nem com o solvente utilizado. Em teste prévio com discos de papel filtro sem aplicação, notou-se que havia escolha de qualquer um dos discos, mas de modo geral, eles não eram notados pelas formigas, ou seja, não era tateados com as antenas. Pode-se inferir, desta forma, que os efeitos observados decorrem da presença de substâncias extraídas da planta.

20

Figura 9 - Frequência de comportamentos observados das formigas em relação aos discos de papel filtro com diferentes tratamentos: CS = Controle Seco, CH = Controle com Hexano, TH10 = Tratamento com Extrato Hexânico a 10µg/ml, TH50 = Tratamento com Extrato Hexânico a 50µg/ml. As mesmas legendas se aplicam aos outros extratos (D = Diclorometano; M = Metanol).

18

Nº de formigas

16 14 12 10 8 6 4 2

0 CS

CM

CS

CD

T10

T50

18

Nº de Formigas

16 14 12 10 8 6 4 2 0 T10

T50

Nº de Formigas

16

Carregou

14 12 10

Carregou e soltou

8 6 4

Tateou e se limpou

2 0 CS

CH

T10

Tratamento

T50

Tateou

Foram observados todos os comportamentos em relação aos discos tratados com hexano em concentração de 50µg/ml e com diclorometano em ambas as concentrações. No restante dos tratamentos, as formigas não carregaram e soltaram. Diferenças significativas, com o teste qui-quadrado, entre os comportamentos de carregar e de tatear e se limpar foram encontradas nos tratamentos T10 e T50 de hexano e T10 de diclorometano, indicado maior repelência do extrato hexânico neste bioensaio. Segundo trabalho de Grzesiuk et al.(2002), que trata do estudo fitoquímico de C. floribundus, foram isolados 2 diterpenos (ácido ent-caur-16en-19-óico e candol B) a partir do extrato hexânico, o que corrobora os dados de repelência por extrato hexânico deste bioensaio, uma vez que testes com diterpenos demonstraram sua eficácia no controle de moluscos e cercárias (Medina et al., 2009), de insetos considerados pragas (Viegas Jr., 2003) e é visto como estratégia anti-herbivoria em Coley & Barone (1996). Outro terpenoide muito eficiente, o epóxido de cariofileno, foi isolado por Hubbell & Wiemer (1983) mostrando atividade repulsiva para as formigas. Já em relação ao extrato metanólico, pode haver a presença de flavonoides, fenóis e glicosídeos (Hubbell, Howard & Wiemer, 1984) atuando na repelência. No trabalho de Boege (2004), por exemplo, o efeito da herbivoria em algumas plantas de floresta tropical seca levou à produção de fenóis e taninos como resposta induzida pelas formigas cortadeiras. Assim, o extrato metanólico, diante destes resultados, se torna referência na busca de compostos fenólicos repelentes.

CONCLUSÕES O teste tópico de toxicidade apresentou problemas com relação ao uso do solvente, número amostral pequeno e deve ser refinado para maior utilização, apesar de já ser largamente utilizado em diversos laboratórios. No entanto, o teste de repelência, se mostrou uma alternativa ao estudo da atividade de produtos naturais em formigas desta espécies, mas que possivelmente pode ser ampliado para outras espécies do gênero. Diferente dos testes de repelência com forrageio livre, esse bioensaio apresenta

independência de dados entre os indivíduos e gera um número amostral significativo para discussão dos resultados. Poderá, portanto, ser utilizado como alternativo no estudo de produtos naturais repelentes. Os dados de repelência apresentados sugerem maior esforço futuro na identificação, isolamento e testes de repelência de diterpenoides extraídos a partir do extrato hexânico. No entanto, o extrato metanólito pode apresentar possível alternativa na busca de compostos fenólicos repelentes às formigas.

AGRADECIMENTOS Agradeço ao Laboratório de fitoquímica e ao IB/USP por toda a Infraestrutura fornecida durante a Iniciação Científica; aos estudantes do laboratório pelas dicas e apoio no laboratório; à minha orientadora, Prof.ª Déborah, por toda ajuda e paciência durante esse tempo; e aos meus amigos que sempre me apoiaram e me ajudaram ao longo de alguns experimentos.

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