SELEÇÃO DE ISOLADOS DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS (Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae) VISANDO O CONTROLE DO BICUDO-DO-ALGODOEIRO (Anthonomus grandis, BOHEMAN 1843) (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) Danielle Thomazoni, Coodetec (Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola /
[email protected]), Luís F.A. Alves (Unioeste – Cascavel), Ely Pires (Coodetec), Pierre J. Silvie (Cirad), Juliana C. Santos, (Unioeste). RESUMO - Este trabalho teve por objetivo identificar isolados de fungos entomopatogênicos das espécies Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae virulentos a adultos do bicudo-do-algodoeiro e também avaliar estratégias de contato no controle do inseto. Foram analisados, em condições de laboratório, 28 isolados provenientes de diferentes hospedeiros e regiões geográficas do Brasil, sendo 24 da espécie B. bassiana e 4 da espécie M. anisopliae. Verificou-se que os isolados de M. anisopliae foram mais patogênicos que os de B. bassiana e que a mortalidade confirmada teve início no 2o dia após a exposição aos conídios. Além disso, o isolado UNIOESTE 22 destacou-se dentre os demais, pois provocou pico de mortalidade entre o 4o e 5o dias após a exposição. Comparando-se a estratégia de aplicação, expondo os insetos ao contato com a cultura esporulada em placa de Petri, o isolado UNIOESTE 22 demonstrou maior eficiência, porém, quando a exposição foi por meio do contato com a cultura do fungo em arroz pré-cozido, o isolado E9 apresentou-se mais adequado. Os isolados e as estratégias demonstraram-se adequadas, sendo necessários estudos mais aprofundados visando aperfeiçoar as estratégias de aplicação prática no campo. Palavras-chave: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Anthonomus grandis SCREENING OF ENTOMOPATHOGENIC FUNGI STRAINS (Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae) AGAINST THE FOR CONTROL OF COTTON BOLL WEEVIL (Anthonomus grandis, BOHEMAN 1843) (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) ABSTRACT - This work aim to identifiy entomopathogenic fungi virulent strains of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae against adults of the cotton boll weevil and also evaluates contact strategies for the control of this insect. Twenty-eight (28) strains, 24 and 4 from the B. bassiana and M. anisopliae species respectively, from diferent host origins and Brazilian geographical regions, were tested in lab conditions. M. anisopliae strains were more pathogenic than the B. bassiana ones and the confirmed mortality begun 2 days after the exposition to conidias. Moreover, the Unioeste 22 strain the others caused a mortality peak between 4 and 5 days after exposition. Comparing aplication strategies, Unioeste 22 and E9 strains were respectively the more efficient with the exposition to Petri dishes cultivated conidias and rice preboiled cultivated conidia media. Strains and aplication methodologies seemed adequate, but additional study is necessary in order to allow practical aplication in the field. Key words: Beauveria-bassiana, Metarhizium anisopliae, Anthonomus grandis
INTRODUÇÃO O sucesso da aplicabilidade do controle biológico por meio de fungos entomopatogênicos está diretamente relacionado ao uso de isolados virulentos. Segundo Lecuona e Delgado (2000), existe a possibilidade de se encontrar isolados virulentos ao bicudo que sejam oriundos do solo ou mesmo isolados do próprio inseto. Estudos realizados nos Estados Unidos com o fungo Beauveria bassiana originaram uma formulação à base de conídios deste fungo denominada Naturalis-L, utilizada no controle do bicudo em nível de campo (SILVA, 2000). Esta formulação foi testada em campo, e verificou-se que o tratamento com o micoinseticida não diferiu do tratamento com inseticida sintético (WRIGHT, 1993). Na América Latina, a literatura apresenta trabalhos sobre seleção de isolados (COUTINHO e OLIVEIRA, 1991, LECUONA e DELGADO, 2000, SILVA, 2000), avaliação de formulações (SILVA et al., 2000), comparações entre fungos e inseticidas químicos (BLEICHER et al., 1994) e avaliação de fungos em armadilhas (COUTINHO e CAVALCANTI, 1988). Com o intuito de obter novos isolados de fungos entomopatogênicos que sejam eficazes no controle do bicudo-do-algodoeiro, foram desenvolvidos no Laboratório de Zoologia da UNIOESTE, Campus de Cascavel - PR, experimentos de seleção de isolados de B. bassiana e Metarhizium anisopliae. Os mais virulentos foram submetidos a uma avaliação de estratégia de contato com o inseto a fim de avaliar o potencial dos mesmos para posterior uso em armadilhas em nível de campo. MATERIAL E MÉTODOS Seleção de Isolados Os experimentos foram conduzidos utilizando adultos do bicudo-do-algodoeiro de uma criação massal do Lab. de Entomologia da Coodetec em Cascavel. Foram avaliados 28 isolados de fungos (24 pertencentes às espécies de Beauveria bassiana e 4 Metarhizium anisopliae) provenientes das coleções do Instituto Biológico de São Paulo, da UEL e UNIOESTE (Tabela 1), mantidos na forma de conídios secos em freezer (-10°C). Os isolados foram inoculados em placas de Petri contendo meio de cultura ME (meio de esporulação) e incubados em câmara B.O.D. (26±1°C, 14 horas de fotofase) durante dez dias, sendo coletados, raspando-se a superfície do meio de cultura, e armazenados a 10°C. Em seguida, os conídios foram suspensos em água destilada + espalhante adesivo (0,01%), sendo as suspensões quantificadas em câmara de Neubauer e padronizadas na concentração de 1 X 108 conídios/mL, nas quais foram imersos os insetos adultos, com idade média aproximada de 8 dias, durante 10 segundos sob agitação manual, sendo utilizados 30 insetos, cada um considerado uma repetição. Para a testemunha, os insetos foram imersos em solução de água destilada + espalhante adesivo (0,01%). Após a imersão, os insetos foram individualizados em caixas de acrílico, contendo dieta artificial para bicudo, desprovida de anticontaminantes, a qual foi trocada a cada quatro dias. As caixas foram mantidas em potes plásticos contendo espuma umedecida e incubadas em câmara tipo B.O.D. (26±1°C e 14 horas de fotofase). Os insetos foram observados diariamente durante dez dias, sendo que os mortos foram retirados e imersos em solução de álcool 70% por 10 segundos, e depois, em água destilada, e mantidos em câmara úmida para confirmação da mortalidade pelo fungo, incubados nas mesmas condições descritas anteriormente, por mais dez dias. Foram selecionados para a etapa seguinte, isolados que provocaram no mínimo 50% de mortalidade confirmada.
Avaliação de estratégia de contato Os isolados selecionados foram produzidos em placas de Petri contendo ME e em sacos plásticos sobre arroz pré-cozido autoclavado e incubados. Após dez dias de incubação instalou-se o experimento. Assim, foi preparada uma placa de Petri contendo cultura esporulada em ME e outra placa com o fundo recoberto pelo arroz + fungo. Em seguida, foram transferidos para cada uma das placas 75 adultos do bicudo, os quais foram deixados por intervalos de tempo variáveis de (2, 5, 10, 20 e 120 minutos). Nos respectivos tempos, foram retirados 15 insetos sendo estes transferidos para caixas de acrílico, incubados e avaliados diariamente, adotando-se o mesmo procedimento experimental descrito no experimento anterior. RESULTADOS E DISCUSSÃO Seleção de Isolados Verificou-se que os isolados avaliados foram patogênicos, havendo grande variação no percentual de mortalidade provocado (3,3 até 56,7%), sendo os isolados de Metarhizium anisopliae mais eficientes que os isolados de Beauveria bassiana (Tab. 1) Com relação aos isolados de M. anisopliae, a mortalidade confirmada de insetos adultos variou de 20,0% e 56,7%, sendo desta espécie os isolados selecionados pela maior eficiência (mínimo de 50,0% de mortalidade confirmada). Estes resultados contrastam com dados de Lecuona e Delgado (2000), os quais registraram pouca eficácia dos isolados de M. anisopliae (5% de mortalidade), em relação aos de B. bassiana (40% de mortalidade confirmada). A maioria dos isolados testados apresentou mortalidade a partir do 6o dia da exposição, como observado por Coutinho e Cavalcanti (1988), que realizaram experimento semelhante, com isolados de B. bassiana. Vale ressaltar que apesar da baixa eficiência dos isolados de B. bassiana testados, observouse que em alguns casos a mortalidade se iniciou a partir do 2o dia após a inoculação, corroborando estudos realizados por Silva et al. (2000). Por outro lado, no trabalho realizado por Wright e Chandler (1991), a mortalidade iniciou-se a partir do 8o dia após o tratamento em adultos, e do 6o dia em pupas de bicudo. Essa variação se deve à variabilidade genética dos isolados utilizados, bem como às condições específicas de cada experimento, como método de inoculação do fungo, tempo de contato com o inseto, concentração do fungo, idade do inseto utilizado e condições de incubação, entre outras.
Tabela 1. Isolados de Beauveria bassiana (Bb) e Metarhizium anisopliae (Ma) utilizados e respectiva porcentagem de mortalidade confirmada sobre adultos de Anthonomus grandis. ESPÉCIE Bb Bb Bb Ma Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Ma Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Bb Ma Ma
ISOLADO UNIOESTE 01 UNIOESTE 04 UNIOESTE 05 UNIOESTE 22 UNIOESTE 26 UNIOESTE 36 UNIOESTE 37 UNIOESTE 38 UNIOESTE 39 UNIOESTE 40 UNIOESTE 42 UNIOESTE 43 UNIOESTE 44 UNIOESTE 45 UNIOESTE 46 UNIOESTE 47 IBCB 17 IBCB 28 IBCB 35 IBCB 74 IBCB 82 IBCB 87 IBCB 241 IBCB 245 IBCB 395 IBCB 440 E9 1037
HOSPEDEIROS/ORIGEM Mortalidade (%) Adulto de Astylus variegatus (Dasytidae) 6,7 Larva de Alphitobius diaperinus (Tenebrionidae), Linha Perobal, Cascavel, PR 13,3 Adulto de A. diaperinus, Linha Perobal, Cascavel, PR 3,3 Solo (plantação de erva-mate), Chácara Destro, Cascavel, PR 56,7 Solo (plantação de erva-mate), Chácara Destro, Cascavel, PR 10,0 Chrysomelidae (hortaliças), Cascavel, PR 10,0 Lagarta de Bombyx mori (Bombycidae), Arapongas, PR 13,3 Lagarta de B. mori, Irati, PR 13,3 Adulto de Cosmopolites sordidus (Curculionidae), S. Miguel do Iguaçu, PR 13,3 Adulto de Curculionidae, Parque Ambiental de Cascavel, PR 16,7 Adulto de Erotylidae, Linha Bom Retiro, Cascavel, PR 10,0 Adulto de Formicidae, (bananal) São Miguel do Iguaçu, PR 50,0 Adulto de Pentatomidae (soja), Faz. Timburi, Toledo, PR 20,0 Adulto de A. variegatus (milho), Faz. Exp. Unioeste, Mal. Cândido Rondon, PR 16,7 Adulto de Euschitus heros, Pentatomidae, Pque. Amb. de Cascavel, PR 13,3 Adulto de Pentatomidae, Faz. Mourão, MT 6,7 Adulto de Anthonomus grandis, Cosmópolis, SP 16,7 Adulto de C. sordidus¸Miracatu, SP 6,7 Adulto de C. sordidus, Cruz das Almas, BA 10,0 Lissorhoptrus oryzophilus (Curculionidae), Japão 20,0 Adulto de C.sordidus, Goiânia, GO 13,3 Adulto de C. sordidus, Goiânia, GO 30,0 Adulto de Oryzophagus oryzae (Curculionidae), Pindamonhangaba, SP 13,3 Adulto de Coleoptera, lavoura de algodão 13,3 Lagarta da banana, Espírito Santo do Pinhal, SP 26,7 Solo, Itapetininga, SP 30,0 Adulto de cigarrinha das pastagens 56,7 Adulto de Solenopsis invicta, Cuiabá, MT 20,0
% de mortalidade confirmada
Neste trabalho foram selecionados três isolados, todos pertencentes à espécie M. anisopliae, e apesar de não diferirem entre si no final do período de avaliação, verificou-se que o isolado UNIOESTE 22 foi o mais virulento de todos, pois entre o 4o e o 5o dia após a inoculação, cerca de 40% dos insetos já tinham confirmado mortalidade, enquanto que para os isolados (E9 e UNIOESTE 43), obteve-se, respectivamente, no mesmo período, 27% e 17% de mortalidade confirmada (Fig. 1).
60 50 40 30 20 10 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Dias após inoculação E9
uni22
uni43
10
Figura 1. Porcentagem de mortalidade diária confirmada de adultos de A. grandis por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae, em condições de laboratório (26±1°C, 14 horas de fotofase). Avaliação de estratégia de contato Observou-se que no tratamento com arroz + fungo, a mortalidade confirmada provocada pelo isolado UNIOESTE 22 variou entre 60% e 80% (Tab. 2), já no tratamento com cultura esporulada, a mortalidade variou entre 60% e 100%. Em ambos os tratamentos, a mortalidade confirmada iniciou-se a partir do 3o e 4o dias, sendo que o maior percentual de mortalidade para o tratamento com a cultura esporulada foi de 100% nos tempos de 20 e 120 minutos, porém, para o contato em arroz + fungo, o maior percentual foi de 80%, e apenas verificado no maior tempo de contato. O maior tempo de exposição também reduziu o tempo de mortalidade, haja vista que na cultura esporulada a mortalidade se concentrou entre o 3o e 4o dias e no contato de 20 minutos houve morte entre o 4o e 6o dias. Em relação ao isolado E9 a mortalidade confirmada se deu entre o 3o e 4o dias, alcançando valores máximos de 80% e de 66,7% no contato com a cultura esporulada, sendo mais eficiente no tratamento em arroz + fungo. Estes resultados demonstram que para o isolado UNIOESTE 22 o melhor tratamento para controle do bicudo foi o de pó-placa, enquanto que para o isolado E9 o tratamento de pó-arroz foi o que mais se destacou, sendo necessário pelo menos 10 minutos de contato entre o fungo e o inseto. Tabela 2. Mortalidade confirmada de adultos de A. grandis expostos a dois isolados de M. anisopliae, em duas estratégias de contato, em condições de laboratório (26±1°C, 14 horas de fotofase). Tempo de contato (minutos) Isolado/Tratamento 2 5 10 20 120 UNIOESTE 22 cultura esporulada 60,0 66,7 86,7 100,0 100,0 arroz+ fungo 73,3 60,0 60,0 60,0 80,0 E9 cultura esporulada 20,0 13,3 66,7 60,0 53,3 arroz+ fungo 33,3 60,0 73,3 60,0 80,0
CONCLUSÔES 1. Os isolados considerados como mais virulentos ao adulto de bicudo foram UNIOESTE 22, UNIOESTE 43 e E9, sendo todos pertencentes à espécie M. anisopliae; 2. O isolado UNIOESTE 22 figurou como o mais virulento e agressivo ao adulto de bicudo; 3. Para o isolado UNIOESTE 22 o meio mais eficiente de aplicação foi o de cultura esporulada; 4. Para o isolado E9 o meio mais eficiente de aplicação foi o de cultura sobre arroz; 5. Precisam ainda ser realizados estudos visando a busca por novos isolados e estratégias de aplicação em nível de campo, a fim de serem utilizados como forma de controle ao bicudo.
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