Artigo Original
Solução de carvão ativado e corante vital para a biópsia de linfonodo sentinela em ratos Vital dye and carbon solution for sentinel lymph node biopsy in rats Rodney Junqueira Pereira1, Renato Santos de Oliveira Filho2, Cláudia Ranauro Zuliani3, Renata Valim de Souza Videira4, Milvia Maria Simões e Silva Enokihara5, Luiz Gonzaga Porto Pinheiro6
RESUMO
ABSTRACT
Objetivo: Determinar se soluções de azul patente V com carvão ativado permitem a identificação do carvão ativado no estudo do linfonodo sentinela em ratos por patologistas. Métodos: Três grupos de 20 ratas foram submetidos ao estudo do linfonodo sentinela em três concentrações diferentes (6, 1 e 0,5%) de solução de Azul Patente V e carvão ativado. Para cada grupo, a solução foi injetada no coxim plantar da pata direita traseira e após 30 minutos foi feita a exérese do linfonodo sentinela na região inguinal de cada rata. Os espécimes retirados foram submetidos ao estudo histológico por coloração hematoxilina-eosina (HE) para identificação do carvão ativado no tecido. Resultados: Todas as lâminas demonstraram no estudo histológico a presença de carvão ativado nos tecidos analisados. As diferentes concentrações apresentaram dificuldades distintas para o estudo: nas lâminas do grupo de 6% a identificação de todas as 20 lâminas foi possível com aumento de 100x; já o grupo de concentração de 1% foi necessário um aumento de 200x e também as 20 lâminas apresentaram o pigmento; no último, de 0,5%, em seis lâminas foi necessária a técnica de imersão (aumento de 100x) para a identificação correta do carvão, todas as outras 14 foram estudadas com aumento de 400x. Conclusão: O estudo do linfonodo sentinela com as soluções propostas foi possível e permitiu corretamente a identificação do carvão ativado no estudo histológico. Logo, a solução de 0.5% seria a mais adequada das três soluções estipuladas para o emprego neste procedimento, pois é a de menor concentração de carvão e que ainda permite o estudo adequado dos tecidos.
Objective: To characterize if blue vital dye and carbon solution allow surgeons and pathologists identify sentinel nodes, not impairing the pathological examination. Methods: Sixty young adult female rats were studied. Three groups of 20 animals were formed and received a blue solution containing 0.5, 1 and 6% of activated carbon, respectively. An injection of patent blue solution with activated carbon was done in the ventral aspect of the right hindpaw. Thirty minutes later, a sentinel node biopsy was performed. Sentinel nodes were submitted to conventional histological study to identify the presence of activated carbon particles within the lymph nodes, as well as their location and distribution. Results: In the group treated with 6% activated carbon solution, identification of activated carbon particles was possible in all 20 slides at 100x magnification; in the 1% group, 200x magnification was necessary. In the last group, 0.5%, in six slides was necessary to use the immersion technique (100x magnification) for correct identification; all 14 slides were adequately studied at 400x magnification. Conclusion: The identification of carbon particles in the histological study was possible in the three groups of activated carbon and patent blue solutions. However, the best solution of vital dye with the least activated carbon concentration was the 0.5% group.
Descritores: Biópsia de linfonodo sentinela; Modelos animais; Ratos; Carvão vegetal; Agentes corantes
Keywords: Sentinel lymph node biopsy; Models, animal; Rats; Charcoal; Coloring agents
INTRODUÇÃO A biópsia de linfonodo sentinela começou a ser realizada no fim do século XX como um procedimento para detectar micrometástases em linfonodos da cadeia de
Trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil. Acadêmico da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Professor-associado da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil; Coordenador do Laboratório de Linfonodo Sentinela, Divisão de Cirurgia Plástica, Departamento de Cirurgia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
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Cirurgião plástico; Membro do Laboratório de Linfonodo Sentinela da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
3
Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Plástica da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
4
Dermatopatologista do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
5
Doutor; Professor-associado, Chefe da Divisão de Mama da Universidade Federal do Ceará – UFC, Fortaleza (CE), Brasil.
6
Autor correspondente: Rodney Junqueira Pereira – Rua Bandeira Paulista, 104, apto.163 – Itaim Bibi – CEP 04532-000 – São Paulo (SP), Brasil - Tel.: 11 2712-3412 – e-mail:
[email protected] Data de submissão: 10/3/2008 – Data de aceite: 16/10/2008
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drenagem(1). Caso haja micrometástase no linfonodo sentinela, o paciente é submetido à linfadenectomia completa; quando o linfonodo sentinela não apresenta micrometástases, não se realiza linfadenectomia. A biópsia do linfonodo sentinela é incluída no estadiamento do melanoma e câncer de mama, de acordo com o manual de estadiamento do câncer do American Joint Committee on Cancer(2). Embora este conceito tenha sido proposto anteriormente, a técnica de mapeamento linfático para a biópsia do linfonodo sentinela em melanoma foi descrita por Morton et al. em 2002(3). O procedimento inclui uma linfocintilografia pré-operatória, biópsia do linfonodo sentinela com o uso do mapeamento linfático com corante vital, detecção gama intraoperatória e exame histológico do linfonodo(3). A linfocintilografia mostra a cadeia linfática e permite a localização do linfonodo sentinela. Na maioria das vezes, a solução do radiomarcado injetada permite que a detecção gama intra-operatória identifique o linfonodo sentinela(4-5). O mapeamento linfático com corante vital simula o trajeto linfático que as células tumorais podem ter seguido, desde a lesão primária até o linfonodo sentinela. Os corantes mais utilizados são o azul patente V e o isosulfan(6). A detecção gama intra-operatória permite a fácil localização do linfonodo sentinela e dissecção menos agressiva. O corante vital e a solução radiomarcada passam rapidamente através do linfonodo sentinela e o patologista não tem qualquer evidência da presença destes no linfonodo. Seria muito útil ter um indicador tecidual que pudesse ser retido no linfonodo sentinela até a realização do exame patológico(7-8). Estudos experimentais sugerem que o carvão ativado é retido por um maior período no linfonodo do que o corante vital e permite a visualização mais fácil durante o período intra-operatório e o estudo histológico(9-11). Um estudo anterior de nosso grupo demonstrou que o carvão ativado a 6% identifica o linfonodo e permanece no linfonodo sentinela durante pelo menos 21 dias. Como o carvão ativado forma uma tatuagem permanente no local da injeção e as altas concentrações prejudicam o exame patológico, seria bastante interessante determinar uma solução de corante vital com concentração mínima de carvão ativado, a qual poderia indicar o linfonodo sentinela para o cirurgião e permitir sua identificação pelo patologista. A remoção total da área de injeção pela excisão ampla ou aumento das margens de ressecção do tumor é necessária para evitar a tatuagem.
MÉTODOS Sessenta ratas adultas (Rattus novergicus: var. albinus, Rodentia Mamalia) Wistar raça EPM-1 foram estudadas, com pesos variando entre 250 e 300 g, provenientes do Abrigo Central de Animais da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Cada animal foi anestesiado com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de 125 mg de cloridrato de tiletamina e 125 mg de zolazepam (ZOLETIL 50) na dose de 1 mg/kg com uma seringa e uma agulha hipodérmica (13 x 4,5 mm).
Objetivo O objetivo deste estudo foi identificar uma solução apropriada de corante vital e carvão ativado.
RESULTADOS Todos os linfonodos sentinela foram identificados macroscopicamente pelas soluções de carvão ativa-
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Injeção de carvão ativado Uma injeção de 0,08 ml da solução de azul patente com carvão ativado foi realizada na porção ventral da pata direita traseira de cada animal. Os animais foram distribuídos em três grupos de 20 animais que receberam a solução azul contendo respectivamente 0,5, 1 e 6% de carvão ativado. Biópsia de linfonodo sentinela Trinta minutos após a injeção da solução, realizou-se uma incisão cutânea desde a região poplítea até a região inguinal, permitindo a identificação de um linfonodo poplíteo com corante. Assim, o linfonodo sentinela foi identificado na fossa poplítea próximo à inserção lateral do músculo gastrocnêmio e a seguir foi dissecado e removido. Trinta minutos após este procedimento, os animais foram sacrificados com uma sobredosagem de anestésico. Estudo histológico As amostras do linfonodo foram seccionadas ao meio de acordo com o maior diâmetro e colocadas em formaldeído 10% para o processamento técnico normal. Foram submetidas ao estudo histológico convencional (método hematoxilina-eosina) para identificar a presença de partículas de carvão ativado no linfonodo, assim como sua localização e distribuição no linfonodo. Considerações éticas e humanas Este projeto foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEP 0126/06). O tratamento dos animais foi realizado de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Solução de carvão ativado e corante vital para a biópsia de linfonodo sentinela em ratos
do e azul patente. Nenhum animal morreu ou apresentou distúrbios clínicos durante o procedimento de biópsia do linfonodo ou após 30 minutos até ser sacrificado. Todas as lâminas de tecidos analisados dos linfonodos sentinela nos três grupos de estudo demonstraram a presença de partículas de carvão ativado nos estudos histológicos. Diferentes concentrações apresentaram diferentes dificuldades caracterizadas pelos patologistas neste estudo: nas lâminas com carvão ativado a 6%, a identificação de todas as 20 lâminas foi possível com o aumento de 100 vezes; no grupo com carvão ativado a 1%, foi necessário o aumento de 200 vezes e todas as 20 lâminas apresentaram pigmentação facilmente identificável. No último grupo, com o uso de carvão ativado a 0,5%, em lâminas de seis linfonodos sentinela foi necessário o uso da técnica de imersão (aumento de 1.000 vezes) para a identificação correta das partículas de carvão ativado; todas as outras lâminas deste mesmo grupo foram estudadas adequadamente com o aumento de 400 vezes sendo suficiente para identificar a pigmentação do carvão ativado no tecido.
DISCUSSÃO A biópsia do linfonodo sentinela é um procedimento minimamente invasivo e é considerado um avanço importante na cirurgia oncológica. Ela seleciona pacientes com micrometástases, os quais devem ser submetidos à linfadenectomia completa. A biópsia do linfonodo sentinela ainda apresenta resultados falso-negativos significativos (3 a 6%)(12). Assim, esses pacientes, embora com linfonodo sentinela negativo, desenvolvem a recidiva da doença na mesma região linfática na qual o linfonodo sentinela foi removido. O exame anatomopatológico de um falso linfonodo sentinela é um importante fator causal de episódios de casos falso-negativos(13). Os corantes vitais usados (azul patente V e isosulfan), assim como o radiomarcado usado na linfocintilografia, não são marcadores permanentes e, portanto, não são identificados pelo patologista. Um marcador duradouro do linfonodo sentinela que não prejudicasse o paciente e pudesse ser identificado pelo patologista seria de valor diagnóstico relevante. Este estudo verificou se três soluções diferentes de corante vital e carvão ativado (0,5, 1 e 6%) poderiam corar o linfonodo sentinela para o cirurgião e permitir a sua identificação no exame anatomopatológico, identificando as partículas de carvão ativado. O principal interesse era o encontro da menor concentração de carvão ativado para alcançar esses objetivos. Este experimento foi baseado em um modelo experimental em ratas, em que o linfonodo sentinela da região posterior da pata era um linfonodo poplíteo(14-15).
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As três diferentes concentrações de carvão ativado permitiram a identificação de partículas de carvão ativado no linfonodo sentinela. Cada solução de carvão ativado apresentou diferentes dificuldades para a visualização do pigmento. Na solução a 6%, todas as lâminas foram facilmente analisadas; o pigmento de carvão foi identificado ao microscópio com aumentos de 100 a 200 vezes em todos os linfonodos sentinela. Na solução a 1%, foi necessário o aumento de 400 vezes para a correta identificação do pigmento. Na solução a 0,5%, foi necessário aplicar a técnica de imersão e o aumento de 1.000 vezes para estudar as lâminas de seis linfonodos sentinela; nos outros 14 linfonodos sentinela do mesmo grupo o aumento de 400 vezes foi suficiente para confirmar a presença de pigmento de carvão ativado. As lâminas do linfonodo sentinela em ratas injetadas com a solução a 6% apresentaram grande quantidade de partículas de carvão ativado que provavelmente dificultam a identificação da micrometástase. Assim, nossos resultados indicam que a solução menos concentrada (0,5%) de carvão ativado e corante azul patente permite a identificação do linfonodo sentinela pelo cirurgião; além disso, o linfonodo sentinela contém partículas de carvão ativado em quantidade suficiente para serem identificadas pelo patologista, provavelmente sem prejudicar a identificação anatomopatológica. A remoção total do carvão ativado do local de injeção por meio de incisão ampla ou aumento das margens de ressecção tumoral é necessário para evitar a formação de tatuagem. Outro estudo poderia responder adequadamente se a solução a 0,5% não produz tatuagem no local primário após a excisão ampla.
CONCLUSÕES O grupo que recebe a solução a 0,5% é o melhor entre as três soluções de azul patente e carvão ativado apresentadas para a obtenção de linfonodos sentinela em ratos. Isto foi baseado em uma menor concentração que ainda permite que o cirurgião, apenas com uma injeção, identifique o linfonodo sentinela e o seu exame patológico apropriado. Neste caso, a pigmentação do tecido não comprometeu a análise das lâminas. A excisão ampla do tumor primário provavelmente evitaria a formação de tatuagem com esta concentração. REFERÊNCIAS 1. Kitajima M, Kitagawa Y. Universal application of sentinel node technology. Ann Surg Oncol. 2004;11(Suppl 3):144S-46S. 2. Balch CM, Buzaid AC, Soong SJ, Atkins MB, Cascinelli N, Coit DG, et al. Final version of the American Joint Committee on Cancer staging system for cutaneous melanoma. J Clin Oncol. 2001;19(16):3635-48.
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