CARLOS ALBERTO DA SILVA, ET AL.
Suprimento de Glicose no Músculo Esquelético Desnervado Glucose Supply in the Denervated Skeletal Muscle RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar se o suprimento de glicose pelos eritrócitos é modificado pela desnervação muscular (15 dias). Estudos têm demonstrado redução na capilarização do músculo desnervado e sugerem que a atrofia está relacionada à redução no suprimento energético. Neste estudo, avaliou-se o peso e o conteúdo muscular de glicogênio, concentração plasmática de glicose na interface artério-venosa femural, o conteúdo eritrocitário de glicogênio e sua mobilização. Os resultados indicaram que a desnervação promoveu redução tanto nas reservas de glicogênio quanto no peso muscular, mostrando uma inter-relação a atividade metabólica e a junção neuromuscular. In vivo observou-se que as reservas eritrocitárias de glicogênio modificam-se de acordo com a glicemia. Há uma diferença artério-venosa na glicemia que perfunde a perna posterior normal ou desnervada e no conteúdo de glicogênio, que se modifica de acordo com a variação da glicemia. In vitro há uma depleção do conteúdo de glicogênio, quando a glicemia é reduzida, e elevação das reservas glicogênicas concomitante à elevação na glicemia (r = 0,942) similar ao observado in vivo. No músculo desnervado observa-se que a distribuição de glicose e a mobilização eritrocitária de glicogênio são similares às observadas nos músculos normais, sugerindo que as modificações homeostáticas induzidas pela desnervação não estão relacionadas à redução no suprimento de substratos metabolizáveis. Palavras-chave ERITRÓCITO – DESNERVAÇÃO – GLICOGÊNIO.
CARLOS ALBERTO DA SILVA* Curso de Fisioterapia – Faculdade de Ciências da Saúde (UNIMEP/SP)
RINALDO ROBERTO J. GUIRRO Curso de Fisioterapia – Faculdade de Ciências da Saúde (UNIMEP/SP)
KARINA MARIA CANCELLIERO Deprtamento de Fisioterapia – Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (UFSCar/SP) *Correspondências: Rod. do Açúcar, km 156, FACIS, 13400-911, Piracicaba/SP
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ABSTRACT The objective of this work was to evaluate if erythrocyte glucose supply changes in the enervated muscle (15 days). Studies have shown a reduction in muscle capillarity in the enervated muscle and suggest that atrophy is related to a reduction in the energetic supply. In this study we evaluated muscle weight and glycogen content, plasmatic glycaemia in arterial/venous in femoral interface and erythrocyte glycogen storage and mobilization. The results show that enervation induced a reduction in muscle glycogen and muscle weight showing the interrelation between muscle metabolism and neuromuscular junction. In vivo, we showed that erythrocyte glycogen reserves were changed according to glycaemia. Plasmatic arteriovenous difference is observed in posterior limb in the normal and the enervated muscle and erythrocyte glycogen reserves changed parallel to glycemia differences. In vitro, we show the occurrence of hydrolysis of glycogen and release of plasma when glycaemia falls and that erythrocyte increases glucose and synthesizes glycogen when glycaemia is enhanced. Some studies suggest that a reduction in capillarity in the enervated muscle contribute to a reduction in energetic supply and atrophy. In the enervated muscle we observed that glucose distribution and erythrocyte glycogen mobilization are similar of that observed in a normal
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muscle. Our data demonstrated that changes in muscle homeostasis, induced by enervation, isn’t related to a reduction of metabolic substrate supply or changes in glycostatic property of erythrocyte. Perhaps a reduction in blood capillarity could be observed in a chronic period of enervation. Keywords DENERVATION – GLUCOSE – ERYTHROCYTE – MUSCLE.
INTRODUÇÃO
A
glicose é o substrato energético preferencialmente utilizado pela musculatura esquelética. Nesse sentido, a captação e o metabolismo da hexose são regulados pela ação da insulina, atividade metabólica tecidual ou atividade contrátil das fibras.10, 28 Avaliações metabólicas realizadas com fibras musculares demonstraram que, após a captação da glicose, aproximadamente de 70% a 85% são direcionados a reservatórios de glicogênio, formando uma reserva diretamente relacionada com a eficiência do trabalho muscular.15 Tem sido observado que, concomitante à desnervação, ocorre perda imediata da atividade voluntária e reflexa do músculo, seguida de atrofia muscular progressiva.29 Nesse sentido, diversos estudos demonstraram que os eventos desencadeados pela desnervação muscular são percebidos a partir do terceiro dia pós-desnervação e estão ligados a alterações na homeostasia energética, como a redução na sensibilidade à insulina, na captação e na atividade das vias reguladoras do metabolismo da hexose, na expressão gênica dos transportadores GLUT 1 e GLUT 4 e na capilarização das fibras musculares, fatores desencadeantes de resistência à insulina e atrofia.2, 4, 17, 23 É conhecido que os eritrócitos distribuem glicose, absorvendo e incorporando-a aos reservatórios de glicogênio, quando ela está elevada, e liberando-a concomitantemente à redução da glicemia.11, 12, 24 Como as reservas de glicogênio superam as necessidades metabólicas dessas células, sugeriu-se que contribuam de maneira importante para o controle glicêmico.11, 12, 14, 18 Recentes pesquisas vêm reunindo informações a favor da hipótese de que os eritrócitos não participam somente do transporte de gases e/ou do equilíbrio ácido base do sangue, mas, de uma dinâmica fina de distribuição de glicose. Nesse ínterim, a literatura mostra a existência de pequenas reservas de glicogênio nos eritrócitos e considera porção remanescente da fase reticulócitos, indicando que o metabolismo do glicogênio não é ativo. Todavia, durante estudos de glicogenoses hepáticas em humanos, Moses et al.19 veri14
ficaram que o eritrócito contém as enzimas glicogênio sintetase e glicogênio fosforilase, responsáveis, respectivamente, pela síntese e pela degradação de glicogênio. Nessas doenças, as enzimas responsáveis pela degradação das reservas de glicogênio estão inativas, possibilitando o acúmulo de glicogênio em concentração maior à observada em eritrócitos de indivíduos normais.19 O metabolismo de glicogênio em eritrócitos normais foi avaliado, utilizando como parâmetro a incorporação de glicose radioativa ao reservatório de glicogênio.5 A taxa de incorporação de glicose para a formação de glicogênio nos eritrócitos atingiu 0,04 ± 0,01 µmol.g Hb-1.h, sendo o valor máximo obtido em pH 7.6 e proposto que o grau de saturação da hemoglobina pelo oxigênio poderia induzir modificações no pH intracelular e, assim, regular a atividade das enzimas envolvidas na síntese de glicogênio.7 A quantidade de glicose captada pelos eritrócitos supera muito as suas necessidades metabólicas, o que implica alta velocidade de transporte de glicose e/ou grande quantidade de transportador na membrana. Lin e Spudich16 estimaram 3 x 105 transportadores em média por célula. Esses transportadores constituem 3,5% das proteínas da membrana, índice superior ao medido na membrana de adipócitos, correspondente a apenas 0,04%.3 O transportador de glicose identificado nos eritrócitos constitui-se de 492 aminoácidos e classifica-se como GLUT 1.6 Ele apresenta um Km (constante de afinidade à glicose) para glicose de aproximadamente 2 mM e in situ exibe um padrão assimétrico de transporte, com Km para efluxo aproximadamente quatro vezes maior e Vmáx (velocidade de captação do substrato) comparado ao influxo.13 A identificação de reservas de glicogênio nos eritrócitos estimulou o interesse em avaliar a função desses depósitos de glicose. Jacquez14 avaliou a glicólise em eritrócitos humanos em 1,1 mmol.h.l1células, a 37oC, e propôs que os eritrócitos seriam importantes para manter o suprimento de glicose cerebral em razão do seu alto número na corrente sanguínea, associado à habilidade de transportar 40% da glicose plasmática. Sob normoglicemia (aproximadamente 5 mM), a concentração de gliSAÚDE REV., Piracicaba, 6(14): 13-18, 2004
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cogênio dos eritrócitos humanos equivale a 12 mil vezes o requerido pelo seu metabolismo. Guarner e Alvarez-Buylla11 constataram que a captação de glicose pelos eritrócitos depende da concentração de glicose no meio a que estão expostos, in vivo e in vitro, ocorrendo incorporação de glicose aos reservatórios de glicogênio durante a elevação da glicemia e, por outro lado, redução nas reservas quando diminui a glicemia. Observaram ainda uma diferença artério-venosa no conteúdo de glicogênio eritrocitário em ratos, sugerindo que os eritrócitos estariam distribuindo glicose aos tecidos, participando da regulação glicêmica. Essa sugestão havia sido antecipada em estudos com eritrócitos de humanos.8 Apesar de serem raras as informações na literatura a respeito das propriedades dos eritrócitos como transportadores de glicose, faz-se necessário avaliar a importância dessas células para a regulação glicêmica local, notadamente em sistemas cuja dinâmica de perfusão sanguínea foi comprometida, como no caso dos músculos desnervados.
OBJETIVOS O objetivo deste trabalho foi analisar a participação dos eritrócitos no oferecimento de glicose, durante a perfusão sanguínea do membro posterior desnervado de ratos.
MATERIAL E MÉTODOS Utilizaram-se 16 ratos machos, Wistar, obtidos do biotério da Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP), os quais receberam água e alimentação ad libitum e mantiveram-se em ambiente com temperatura constante (23oC ± 2oC) e ciclo claro/escuro de 12h. Permaneceram em gaiolas coletivas (quatro animais por caixa), constituindo os grupos experimentais controle e desnervado 15 dias, n = 8. A desnervação ocorreu após anestesia com éter e abertura de 0,5 cm da pele, através da qual fez-se a secção unilateral do nervo ciático do membro posterior direito, segundo proposta de Coderre et al.4 Com o intuito de avaliar as reservas eritrocitárias de glicogênio, adotou-se inicialmente o protocolo in vivo para a análise das hemáceas coletadas na interface artério-venosa que perfunde o membro posterior normal. Para constituir importantes fontes de glicose, os eritrócitos devem armazenar glicogênio em virtude da variação da glicemia. AsSaúde em Revista SUPRIMENTO DE GLICOSE NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DESNERVADO
sim, também foram realizadas análises in vitro para avaliar o comportamento das reservas eritrocitárias de glicogênio diante da variação na concentração de glicose (0, 40, 80, 120, 160, 200 e 240 mg/dL) no meio de incubação. Para coleta de amostras, anestesiaram-se os ratos com pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p) e o sangue coletado da veia e da artéria femural foi prontamente encaminhado para determinação do conteúdo de glicogênio, segundo proposta de Farquarson et al.7 A seguir, o sangue foi centrifugado e o plasma isolado para avaliação bioquímica da glicemia através de kit de utilização laboratorial. As amostras do músculo sóleo e gastrocnêmio foram coletadas e digeridas em KOH 30% a quente e o glicogênio precipitado a partir da passagem por etanol. Entre uma fase e outra da precipitação, a amostra foi centrifugada a 3.000 rpm, durante 15 minutos. O glicogênio precipitado submeteu-se a hidrólise ácida na presença de fenol, segundo proposta de Siu Lo et al.27 Os valores estão expressos em mg/100 mg de peso úmido. Avaliou-se a significância estatística pela aplicação de análise de variância, seguida do teste "t" de Student, admitindo como significativos os valores de p < 5%. Os resultados aparecem expressos como médias e seus respectivos erros-padrões.
RESULTADOS Inicialmente, analisou-se o efeito da desnervação sobre o conteúdo muscular de glicogênio. A figura 1 demonstra que o grupo desnervado apresentou uma redução nas reservas, atingindo valores 51% menores no músculo sóleo e 61% no gastrocnêmio (p < 0,05). Cabe ressaltar que, concomitantemente às alterações metabólicas desencadeadas pela desnervação, também houve redução no peso, atingindo 49% (p < 0,05) no músculo sóleo (fig. 2). A figura 3 mostra uma diferença de 16,7% entre a concentração de glicogênio dos eritrócitos coletados na artéria femural (AF) e na veia femural (VF), sendo significativamente maior no ramo arterial (p < 0,01). A diferença artério-venosa periférica sugere que os eritrócitos poderiam estar liberando glicose para os tecidos, durante o trânsito pelos capilares. Essa distinção é simultânea à observada na figura 4, na qual se percebe uma concentração de glicose plasmática na artéria 25,4% maior do que na veia femural (p < 0,05). 15
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Figura 1. Concentração de glicogênio (mg/100 mg) nos músculos sóleo (S) e gastrocnêmio (G) controle (C) e desnervados 15 dias (D). Os valores correspondem à média ± epm, n = 6. *p < 0,05 comparado ao controle.
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Figura 2. Peso do músculo sóleo (mg) dos grupos normal e desnervado 15 dias. *p < 0,05 comparado ao normal.
A elevação no conteúdo de glicogênio concomitante à ocorrida na concentração de glicose do meio pode ser constatada na figura 5. Esse comportamento revela uma correlação elevada entre a glicemia e a concentração eritrocitária de glicogênio (r = 0,94). No entanto, foi também necessário demonstrar que os eritrócitos liberam glicose à medida que a concentração dessa substância do meio se reduz. A figura 6 mostra a concentração eritrocitária de glicogênio em células inicialmente incubadas na presença de 240 mg.dl-1 de glicose, com acúmulo de glicogênio e posterior redução do seu conteúdo, ao serem novamente incubadas em concentrações mais baixas de glicose (correlação, r = 0,83). Figura 5. Concentração de glicogênio (µg/gHb) em eritrócitos incubados em concentrações crescentes de glicose: efeito de carga in vitro. Os valores correspondem à média ± epm, n = 6. * p < 0,05 comparado à concentração anterior.
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Figura 3. Concentração de glicogênio (µg/gHb) na artéria femural (AF) e veia femural (VF) de ratos controle e desnervados 15 dias (D). Os valores correspondem à média ± epm, n = 6. *p < 0,05 comparado ao outro compartimento. Figura 6. Concentração de glicogênio (µg/gHb) em eritrócitos incubados em diferentes concentrações de glicose: efeito descarga in vitro. Os valores correspondem à média ± epm, n = 6. * p < 0,05 comparado à concentração anterior.
Figura 4. Concentração plasmática de glicose (mg/dL) na artéria femural (AF) e veia femural (VF) de ratos controle e desnervados 15 dias (D). Os valores correspondem à média ± epm, n = 6. * p < 0,05 comparado ao outro compartimento.
DISCUSSÃO Na musculatura esquelética em repouso, a glicose é captada por transportadores do tipo GLUT 1, que suprem energeticamente o metabolismo basal das fibras, mantendo a homeostasia.9, 21 Ao avaliarmos o efeito da desnervação na musculatura esquelética, verificamos que houve redução tanto no 16
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conteúdo de glicogênio quanto no peso muscular. Esses dados demonstram que a interrupção na atividade motora promove modificações homeostáticas e funcionais nas fibras musculares, predispondo à hipotrofia, como demonstramos anteriormente.26 A manutenção da normoglicemia depende da integridade dos sistemas nervoso e endócrino, principais reguladores da dinâmica de mobilização das reservas energéticas e das funções glicostáticas hepáticas como maior reservatório de glicose.30 Diversos estudos têm demonstrado, nos eritrócitos, a presença das enzimas amiloglicosidase, glicogênio sintetase e fosforilase, que contribuem para a formação do reservatório de glicogênio e sua utilização.19, 20 No que tange às funções glicostáticas eritrocitárias, sabe-se que elas desempenham importante papel na distribuição de glicose, conforme sugerido por Jacques.14 Essa função dos eritrócitos tem sido relegada a um plano secundário, em virtude do grande reservatório de glicogênio e da rapidez com que ele é mobilizado e reconstituído no fígado de indivíduos normais. Todavia, este estudo mostra que o acesso ao reservatório representado pelos eritrócitos é muito mais fácil que aos demais tecidos, permitindo várias amostragens em análises de longa duração, sem provocar grande estresse aos animais. Os primeiros estudos sobre o armazenamento de glicogênio em eritrócitos mostraram baixas concentrações por conta da inadequação das técnicas à extração do glicogênio da amostra e da baixa sensibilidade dos métodos de medida. Em nosso estudo, adotamos uma técnica desenvolvida para melhorar a quantificação do glicogênio eritrocitário, com sensibilidade para detectar até 0,1 µg de glicogênio.7 As análises do metabolismo da glicose em eritrócitos de humanos realizadas na década de 50 detectaram a utilização de glicose de 5,58 µmol/min/ml de células e sugeriram que as reservas citosólicas excedem as necessidades energéticas.20 Se levarmos em conta o baixo consumo de glicose pelos eritrócitos, o diferencial sugere uma liberação da glicose, e não a sua utilização pelos eritrócitos, como se pode observar nos experimentos in vivo relacionados à redução das reservas durante a perfusão periférica. Cabe salientar que as concentrações eritrocitárias de glicogênio obtidas neste estudo estão dentro dos limites constatados por Collins et al.,5 entre 1 e 60 µg.g-1 Hb. Esses autores também retratam a baixa taxa Saúde em Revista SUPRIMENTO DE GLICOSE NO MÚSCULO ESQUELÉTICO DESNERVADO
de oxidação de glicose em eritrócitos de ratos, de 0,7 mg/min/100 g de peso.25 Jacquez14 confirmou os estudos pioneiros, demonstrando que o conteúdo de glicose intra-eritrocitário supera 12 mil vezes as necessidades metabólicas e sugerindo que os eritrócitos transportam glicose. O fato de a literatura registrar redução na capilarização tecidual concomitante à desnervação instigou a avaliação do comportamento das reservas glicogênicas eritrocitárias no membro desnervado. Inicialmente, avaliamos in vitro o comportamento das reservas eritrócitárias de glicogênio em face da variação na concentração de glicose no meio de incubação. Verificamos que houve elevação nas reservas, quando os eritrócitos foram incubados em concentração crescente, e diminuição nas reservas, quando incubados em concentrações decrescentes. Isso mostra a plasticidade dos eritrócitos como mobilizadores de glicose concomitante à variação na glicemia, como sugerido por Guarner e Alvarez Buylla,12 demonstrando a importância dessas células na distribuição local de glicose e na regulação fina da glicemia. Nesse sentido, nosso estudo in vivo mostra uma diferença artério-venosa nas reservas glicogênicas eritrocitárias, durante a perfusão do membro posterior, e, mesmo estando o músculo desnervado, não houve modificação na dinâmica glicostática eritrocitária. É interessante ressaltar que as alterações quimiometabólicas verificadas na musculatura desnervada estão centradas em respostas teciduais desencadeadas em detrimento de alterações na funcionalidade da junção neuromuscular. Esse fato não apresentou, no período observado, relação direta com alterações na disponibilização e na distribuição de substratos metabolizáveis, em especial a glicose.
CONCLUSÕES Diante dos resultados obtidos, concluímos que: • in vitro a incorporação ou liberação de glicose na reserva eritrocitária de glicogênio correlacionou-se fortemente (r = 0,942) com a variação da glicose do meio de incubação; • tanto no músculo normal como no desnervado, os eritrócitos coletados na artéria femural possuem reservas de glicogênio maiores do que na veia femural, sugerindo que essas células participam do transporte e da distribuição de glicose aos tecidos; • a desnervação não altera o padrão eritrocitário de distribuição de glicose periférica. 17
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