SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE SWAB UTERINO E DA FOSSA CLITORIANA DE ÉGUAS COM SUBFERTILIDADE

Jacob, J. C. F. et al., 2002

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SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE SWAB UTERINO E DA FOSSA CLITORIANA DE ÉGUAS COM SUBFERTILIDADE JULIO CÉSAR FERRAZ JACOB1 VERA LUCIA TEIXEIRA DE JESUS 1 HELCIMAR PALHANO BARBOSA2 MARINA FERREIRA ZIMMERMAN4 ANDREA GOMES DA SILVA3 CELY MARINI MELO3 ABSTRACT: JACOB, J. C. F.; JESUS, V. L. T. de; BARBOSA, H. P.; ZIMMERMAN, M. F.; SILVA, A. G. da; MELO, C. M.; Antimicrobic susceptibility of uterine and clitoral swabs of mares with endometritis. Rev. Univ. Rural, Sér. Ciên. da Vida, V.22 n2, 2002 (Suplemento), p. 109-114. 15 uterine swabs and 15 clitoral fossa swabs were examinated from Mangalarga Marchador mares with endometritis. The mares were from Rio de Janeiro and Minas Gerais and were examinated during the 2001 breeding season.Twenty five swabs (83,3%) had bacterial growth. The following bacteria were isolated from the uterine swabs: Enterobacter sp. (30,8%), Escherichia coli (23,0%), Streptococcus sp (15,4%), Proteus sp. (15,4%), Klebsiella sp (7,7%), and Citrobacter sp (7,7%). Clitoral fossa isolated were: Escherichia coli (33,3%), Klebsiella sp (25,0%), Enterobacter sp. (16,7%), Citrobacter sp (16,7%), and Streptococcus sp (8,3%). In vitro antimicrobial susceptibility tests from uterine samples indicated that microrganisms were susceptible to sulfazotrin (86,0%), enrofloxacin and florfenical (77,7%). Microrganisms isolated from the clitoral fossa cultures were more susceptible to enrofloxacin (96,0%) and florfenical (92,0%).13,8%were resistant to neomicin, and 16,6% were resistant to penicillin. KEY WORDS: Antimicrobic susceptibility, mares, sub fertility, uterus, clitoral fossa.

INTRODUÇÃO O lúmen uterino de uma égua fértil normal é bacteriologicamente estéril e tem a capacidade de recuperar-se da contaminação natural ocorrida após o acasalamento ou procedimentos veterinários. A resposta natural do útero às bactérias introduzidas nesse período, devese a liberação de neutrófilos pelo endométrio, resultando em uma resposta inflamatória que combate às bactérias

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Professor do Instituto de Zootecnia da UFRuralRJ; Coordenador de Assistência Técnica Schering Plough Coopers; 3 Aluna do Curso de Medicina Veterinária da UFRuralRJ; 2

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Médico Veterinário Autônomo.

geralmente dentro de 24 horas. Os subprodutos deste evento aparecem como fluído, naturalmente eliminado, deixando o útero estéril dentro de poucos dias (HASSLER, 2002; PYCOCK, 1999). Endometrite refere-se à inflamação aguda ou crônica da camada interna do útero, o endométrio. Como descrito acima são normais breves episódios de endometrite transitórias, ainda por complicações outras como deficiência no mecanismo de defesa da resposta imune humoral ou celular (WATSON & STOKES, 1990) ou pela contratilidade uterina inadequada (TROEDSSON & LIU, 1991) causando uma endometrite persistente. As alterações uterinas em conseqüência de infecções bacterianas, resultam em falhas de concepção, resultado direto da ação dos microrganismos que penetram no útero,

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diminuindo de forma considerável, as chances de uma gestação a termo (GASTAL et al., 1989). Uma variedade de microrganismos vem sendo considerada causadora de infertilidade em éguas, morte fetal e infecção neonatal. Esta associação não está bem esclarecida, muitos desses microrganismos têm sido cultivados à partir de éguas e garanhões com fertilidade normal e sem evidência clínica da doença. Contudo, é sabido que garanhões albergam uma variedade de bactérias no trato genital, principalmente na genitália externa, as quais são transferidas para as éguas no momento da cobertura. LANGONI et al. (1994) de 810 amostras de swabs uterinos colhidos de éguas de diferentes raças, isolaram Streptococcus sp. (40,6%); Staphylococcus sp. (23,5), Escherichia coli (12,3%), Rhodococcus equi (7,4%), Klebsiella pneumonie (3.6%), e em menor freqüência Cândida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Alcaligenes fecalis e outros. Estes - quando submetidos ao teste de susceptibilidade antimicrobiana - demonstraram maior sensibilidade ao cloranfenicol e gentamicina. SILVA et al. (1999) de 206 swab uterinos e cervicais de éguas de várias raças de diversas regiões do Estado de Minas Gerais, encontraram em 164% swabs presença de microrganismos causadores de endometrites, tendo sido isolado Streptococcus equi subesp. zooepidemicus (25,7%), Escherichia coli (15,1%), Staphylococcus aureus (9,2%), Pseudomonas aeruginosa (3,9%), sensíveis in vitro a amicacina e gentamicina (70,2%), ampicilina (59,5%) e cloranfenicol (59,5%). Segundo WATSON & STOKES (1990), a presença de Streptococcus equi subesp. zooepidemicus está associada aos casos de endometrites persistentes. O ambiente vaginal bem como o lúmen cervical apresenta isolamento de microrganismos superior ao uterino (McKINNON, 1992). A flora bacteriana da fossa clitoriana eqüina, a qual é constituída freqüentemente por: Escherichia coli, Streptococcus faecalis,

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Corinebacterium spp, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp (b-hemoliticus), Staphylococcus albus e Pseudomonas aeruginosa (McKINNON, 1992), deve ser cultivada para o diagnóstico da endometrite. O tratamento de éguas com infecção bacteriana deve-se iniciar com a eliminação das causas predisponentes (cirurgia para pneumovagina e/ou técnicas de cobertura melhoradas), além de manejo para minimizar contaminações, acompanhada pela terapia de lavagem e subseqüente infusão de antibióticos de longo espectro, sendo ideal a identificação do microrganismo e a realização do antibiograma (HASSLER, 2002). O tratamento terapêutico das endometrites inclui o uso de imunoestimulantes e a aplicação de antibióticos por via sistêmica ou por infusões uterinas (ZINGHER, 1996). A seleção do antibiótico deve ser baseada tanto na determinação da prevalência das bactérias causadoras e a susceptibilidade desses microrganismos frente aos antibióticos (SILVA et al., 1999). Em éguas tratadas com gentamicina, houve uma melhora na taxa de concepção, segundo HOUDERHELL & HENNESSEY, (1972). Novos antibióticos de amplo espectro como a enrofloxacina, administrada intravenosamente em éguas, demonstrou 90% de sensibilidade para S.aureus, E.coli, Salmonella sp, Klebsiella spp e Pasteurella sp. (HAINES et al., 2000), tendo a mesma sido utilizada nesse trabalho para o tratamento parenteral de éguas com endometrite. A lavagem uterina é uma forma de tratamento bastante citada, utilizada tanto isoladamente quanto associada a antibióticos, porém, nenhum estudo controlado documentou ou rejeitou sua eficácia, a qual consiste na remoção de microrganismos, neutrófilos afuncionais, substâncias que interfiram na potência de antibióticos e, neutrófilos funcionais que estimulam a contratilidade uterina, ajudando na limpeza física do útero (HASSLER, 2002). O uso indiscriminado de antibacterianos não diminui a incidência da

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metrite ou infertilidade em éguas. Em estudo recente sobre amostras isoladas de éguas com infecção uterina, não foram sensíveis a penicilina, clorotetraciclina, estreptomicina, oxitetraciclina e sulfonamidas. Em outras amostras foram sensíveis ao cloranfenicol e gentamicina; mas em questão de tempo, devido ao seu uso indiscriminado, tornaram-se resistentes (LlOYD & ABBITT, 1996). A indicação da terapia antimicrobiana, no caso de infecção microbiana patológica do útero, deve-se considerar cultura positiva mais sinais clínicos ou histórico de infertilidade, ou ambos. O objetivo desse trabalho foi determinar a susceptibilidade à ação antimicrobiana in vitro de antibióticos utilizados na rotina para tratamento da endometrite eqüina. MATERIAL E MÉTODOS Durante a estação de monta de 2001, 15 éguas da raça Mangalarga Marchador, com idade entre cinco e dez anos, submetidas ao processo de coleta de embriões para a transferência, que apresentam o histórico de presença de muco sujo durante a coleta do lavado de embriões, e permaneceram vazias ao término da estação. As éguas examinadas foram provenientes de três diferentes haras, com o mesmo manejo reprodutivo (inseminação artificial e transferência de embriões), situado nos municípios de Muriaé e Leopoldina do Estado de Minas Gerais, e do município de Seropédica do Estado do Rio de Janeiro. Com intuito de determinar a eficiência in vitro dos antibióticos utilizados para o tratamento da endometrite eqüina, procedeu-se coleta bacteriológica da fossa clitoriana e do conteúdo uterino. Para tal, as éguas foram contidas adequadamente em tronco, sua cauda envolvida com uma bandagem e presa para cima. Para coleta do conteúdo da fossa clitoriana, antes de fazer a assepsia da região perivulvar e vulvar, fazia-se a inversão da região ventral dos

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lábios vulvares, e com isso exteriozava-se o clitóris. Então, o swab era introduzido na fossa clitoriana, e assepticamente acondicionado no meio de transporte Stuart, mantido à temperatura ambiente. Em seguida, realizou-se, então, a higienização da região perivulvar e perineal com água e sabão neutro, e enxuta com papel toalha descartável. Para a coleta do swab uterino, utilizou-se uma luva de palpação estéril e lubrificada com KY Gel (UPHOJON). O swab estéril era seguro, protegido na palma da mão e introduzido na vagina. Com o dedo indicador na cervix, o swab foi guiado para dentro do útero e movido para frente e para trás várias vezes enquanto estava em contato com o endométrio. O swab era então removido do útero e novamente protegido na palma da mão retirando-a do trato reprodutivo. Após a retirada do swab, era acondicionado ao meio de transporte Stuart e mantido à temperatura ambiente por 24h, em seguida refrigerado, (swab uterino e da fossa clitoriana) e enviado ao laboratório, para proceder ao isolamento bacteriano e antibiograma. No laboratório, o swab coletado do útero e da fossa clitoriana foram incubados a 37°C por 24 horas e após esse período, procedeu-se a semeadura em placas de agar sangue, acrescido de 5% de sangue bovino desfibrinado e incubação em aerobiose e microaerofilia, por um período de 24 a 96 horas. A identificação dos microrganismos foi realizada segundo as recomendações de KRIEG & HOLT (1984), e os testes de susceptibilidade a antimicrobianos, pelo método de difusão em disco (BAUER et al., 1966), sendo utilizado 10 antibióticos assim discriminados: Amicacina (AM 10mcg), Cefalotina (CFT 10mcg), Cloranfenicol (CL 30 mcg), Enrofloxacina (ENO 10mcg), Florfenicol (FLO 30mcg), Gentamicina (GEN 10mcg), Neomicina (NO 30mcg), Penicilina (PEN 10 UI), Sulfazotrim (SFT 25mcg) e Tetraciclina (TT 30mcg). Os critérios de interpretação dos halos de inibição forma aqueles estabelecidos pelo fabricante dos discos de antibiograma.

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RESULTADOS Das 15 éguas vazias ao término da estação de monta, com a presença de muco sujo após coleta de embriões, foram isoladas bactérias do conteúdo uterino de 11 éguas (73,3%) as quais apresentaram crescimento bacteriano. Os microrganismos isolados foram Enterobacter sp. (30,8%), Escherichia coli (23,0%), Streptococcus sp (15,4%), Proteus sp. (15,4%), Klebsiella sp (7,7%), Citrobacter sp (7,7%). os quais estão demonstrados na tab. 1. Tabela 1. Distribuição dos microrganismos isolados do conteúdo uterino. Microrg. isolado Escherichia coli Klebsiella sp Enterobacter sp Citrobacter sp Streptococcus sp

Freq. Isolamento (%) 33,3 25,0 16,7 16,7 8,3

Quanto ao isolamento de bactérias da fossa clitoriana, das 15 éguas houve isolamento em 12 (80%). Foram identificados: Escherichia coli (33,3%), Klebsiella sp (25,0%), Enterobacter sp. (16,7%), Citrobacter sp (16,7%), Streptococcus sp (8,3%), demonstrados na tab. 2. Nos testes de susceptibilidade diante dos antimicrobianos utilizados, observou-se que a maioria dos microrganismos foi sensível in vitro a ação da sulfazotrim (86,0%), seguidos pelo enrofloxacina e florfenicol (77,7%), gentamicina e cloranfenicol (69,3%) no caso dos isolamentos de swab uterino. Quanto à sensibilidade dos microrganismos da fossa clitoriana os mais sensíveis foram enrofloxacina (96,0%) e florfenicol (92,0%). E resistentes a neomicina e penicilina (13,8% e 16,6%), para os cultivos da fossa clitoriana e uterino, respectivamente, demonstrados nas tabelas 3 e 4.

Tabela 2. Distribuição dos microrganismos isolados da fossa clitoriana.

Microrg. isolado Escherichia coli Klebsiella sp Enterobacter sp Citrobacter sp Streptococcus sp

Freq. Isolamento (%) 33,3 25,0 16,7 16,7 8,3

Tabela 3. Susceptibilidade antimicrobiana do conteúdo uterino de éguas com endometrite. Antib AM CFT CL ENO FLO GEN NO PEN SFT TT

Enterobacter % 25 0 100 100 100 50 0 25 100 75

Citrobacter Proteus sp Klebsiella sp. % % % 100 100 0 0 0 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 100 100 0 0 0 0 0 100 0 100 100 100 100 0 0

Streptococcus % 100 100 50 100 100 100 50 50 50 0

E. coli % 33 33 66 66 66 66 33 0 66 33

sensibilidade % 59,66 22,16 69,30 77,66 77,66 69,30 13,83 29,16 86,00 34,66

Antibióticos: AM-Amicacina, CFT-Cefalotina, CL-Cloranfenicol, ENO Enrofloxacina, FLO-Florfenicol, GENGentamicina, NO-Neomicina, PEN -Penicilina, SFT-Sulfazotrim, TT-Tetraciclina.

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Tabela 4. Susceptibilidade antimicrobiana da fossa clitoriana de éguas com endometrite. Antib AM CFT CL ENO FLO GEN NO PEN SFT TT

E coli % 20 0 60 80 60 20 0 0 60 20

Klebsiella % 0 33 100 100 100 66 33 33 100 33

Enterobacter Streptococcus sp % % 100 100 50 100 50 0 100 100 100 100 50 100 0 100 0 0 100 0 50 0

Citrobacter % 50 0 100 100 100 50 0 50 100 0

sensibilidade % 54,00 36,66 62,00 96,00 92,00 57,20 26,60 16,60 72,00 20,60

Antibióticos: AM-Amicacina, CFT-Cefalotina, CL-Cloranfenicol, ENO Enrofloxacina, FLO-Florfenicol, GENGentamicina, NO-Neomicina, PEN -Penicilina, SFT-Sulfazotrim, TT-Tetraciclina.

DISCUSSÃO Quanto aos microrganismos isolados tantoda fossa clitoriana, como do útero, Enterobacter sp. , Escherichia coli, Streptococcus sp, Proteus sp.; Klebsiella sp, Citrobacter sp., há controvérsia de sua importância no quadro da endometrite eqüina. Alguns autores acham que sua presença diminui a fertilidade e outros acham ser insignificante caso não se tenha o acompanhamento do histórico de falha reprodutiva ou evidência clínica da doença. Deve ser levado em conta também outro fatores como: a idade, deformidade da área perineal com subseqüente pneumovagina, desequilíbrio endócrino, cobertura por monta natural, perda do potro ou falta de higiene, que contribuem para o desenvolvimento da infecção do trato genital em éguas (LlOYD & ABBITT, 1996). Os resultados dos exames microbiológicos do útero foram positivos em 73,3% (11/15) das éguas, tendo sido isolado com maior freqüência Enterobacter sp. (30,8%), Escherichia coli (23,0%), Streptococcus sp (15,4%). E, sensíveis in vitro a sulfazotrim (86,0%), enrofloxacina e florfenicol (77,7%), seguido de gentamicina e cloranfenicol (69,3%). Enquanto para o isolamento da fossa clitoriana a susceptibilidade antimicrobiana foi mais evidente para a enrofloxacina e florfenicol (96,0 % e 92,0%), respectivamente. De acordo com SILVA et

al. (1999) e LANGONI et al. (1994) esses microrganismos são mais freqüentemente isolados em caso de endometrite eqüina, sendo responsáveis pelo quadro de subfertilidade.Com referência a sensibilidade frente aos diferentes antimicrobianos testados, difere dos achados de SILVA et al. (1999), que foram mais sensíveis a amicacina e gentamicina (70,2%), ampicilina e cloranfenicol (59,5) e dos achados de LANGONI et al. (1994), cloranfenicol e gentamicina. Sendo os antimicrobianos de maior sensibilidade encontrados em nosso estudo, florfenicol e enrofloxacina existentes no mercado há cerca de cinco anos, o que comprova que o uso indiscriminado de antibióticos diminui a sua ação antimicrobiana, como ocorreu com a gentamicina que apresentou uma sensibilidade de (57,2%). CONCLUSÃO Pode-se concluir que a rotina de coleta de swab bacteriológico e a realização do antibiograma, permitiram a recuperação das fêmeas tratadas contra endometrite com enrofloxacina para o programa de transferência de embriões. Portanto houve concordância entre o teste in vitro e in vivo nesse trabalho.

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