Técnicas de siembra

Técnicas de siembra

En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axénicos).
Aislamiento: Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. El método más usual es la siembra por estría simple sobre un medio de cultivo sólido adecuado dispuesta en una placa de petri.


Para ello se toma una pequeña cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las células bacterianas. Tras la incubación en condiciones adecuadas, cada célula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares.


Cada colonia bacteriana tiene unas características determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.




Estrías múltiples
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.
Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida.
Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de gérmenes.








Técnica de los cuatro cuadrantes:
Se divide la placa en cuatro cuadrantes.
Se toma el inoculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4.Incubar.
En el cuarto cuadrante, al menos, obtendríamos colonias aisladas.





Estría por agotamiento

Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:

Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres cuadrantes de la caja de Petri, para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.


El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.


Por picadura o punción

Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal de punción, trayecto por el cual la retiraremos luego. Este método se utiliza para estudiar la movilidad de los microorganismos.
Medio de cultivo. Semisólido (Medio SIM y MIO)
Instrumento: aguja bacteriológica


















Por picadura y estría en la superficie:

En este método se siembra por picadura en el fondo del tubo y a medida que va saliendo del botón se realiza una estría en la superficie del gel, esto se hace con la finalidad de estudiar los cambios que ocurrirán en superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su comportamiento frente a los nutrientes del medio.






Asada en caldo:

Se esteriliza el asa y se toma el inoculo con el asa con punta redondeada y se esteriliza la boca del tubo y el tapón y posteriormente se introduce el asa dentro del tubo que contiene medio líquido y se agita con dos o tres movimientos circulares, se saca el asa del tubo y se vuelve a esterilizar para eliminar el exceso de microorganismo que haya quedado adherido.



Técnica de Barry o vaciado en placa

En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.















Técnica de dilución seriada

Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan después de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el número de células aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, también se utiliza para el conteo de esporas fúngicas presentes en la muestra.

La muestra a inocular debe ser homogénea y no contener conglomerados de células. Después de la incubación cada microorganismo o célula viable formará una masa visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el número de colonias permitirá a su vez determinar el número de organismos viables en la muestra sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad.

Generalmente la muestra original se diluye para que el número de colonias desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y así permitir un óptimo crecimiento y facilitar la lectura. En primer lugar, la muestra se diluye seriadamente, transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. Este proceso se repite hasta obtener una dilución apropiada en este ejemplo, 1:100000 (10-5). Posteriormente se añade 0,1 ml a una placa de agar nutritivo, bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. Debido a razones estadísticas, las placas deben contener entre 30 y 300 colonias.

Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el factor de dilución. Los resultados se expresan en colonias por ml. Los resultados también pueden expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el número relativo de microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un metro cúbico de muestra.


Técnica de siembra con asa de Dygralski

Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente la dilución. Consiste en depositar sobre la superficie de una placa con agar una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado de un asa de Dygralski, previamente
esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.





Todas las técnicas de siembra van acompañadas de una incubación, las placas, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Y los tubos en posición vertical en una gradilla o frasco de contención.


El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. Entre ellos destacan:

Disponibilidad de nutrientes adecuados
Consistencia adecuada del medio
Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Condiciones adecuadas de humedad
Luz ambiental
pH
Temperatura
Esterilidad del medio