Tese 2015 - Henrique dos Santos Antunes - IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS ENDODÔNTICOS NO SEGMENTO APICAL DE DENTES COM LESÃO PERIRRADICULAR PÓS-TRATAMENTO

HENRIQUE DOS SANTOS ANTUNES

IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS ENDODÔNTICOS NO SEGMENTO APICAL DE DENTES COM LESÃO PERIRRADICULAR PÓS-TRATAMENTO

2015

Programa de Pós-Graduação em Odontologia i Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580, cobertura 22790-710 – Rio de Janeiro, RJ Tel. (0XX21) 2497-8988

HENRIQUE DOS SANTOS ANTUNES

IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS ENDODÔNTICOS NO SEGMENTO APICAL DE DENTES COM LESÃO PERIRRADICULAR PÓS-TRATAMENTO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, visando obtenção do grau de Doutor em Odontologia (Endodontia)

Orientadores: Prof. Dr. José Freitas Siqueira Júnior Profa. Dra. Isabela das Neves Rôças Siqueira UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO 2015 ii

DEDICATÓRIA _______________________________________________________________

Aos meus pais, Edelto (in memoriam) e Rosane Ellen, por nunca terem desistido de mim e por terem me ensinado valores que levarei comigo pra sempre. À minha esposa (Suzana) e aos meus amados filhos (Bernardo, Pedro Henrique, Arthur e Beatriz), pela paciência, companheirismo e pelo grande amor que demonstram ter por mim. Sem eles nada disso seria possível.

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AGRADECIMENTOS _______________________________________________________________

A Deus por ter permitido que eu pudesse chegar até aqui. Senhor, a ti seja dada toda honra e toda glória. À minha amada esposa, Suzana, pela amizade, companheirismo, paciência, ternura, incentivo e por mostrar o quanto me ama. Filha, você é o meu porto seguro. Aos meus quatro, sim isso mesmo, quatro filhos (Bernardo, Pedro Henrique, Arthur e Beatriz), por terem, em muitos momentos, entendido o fato do papai não estar tão presente quanto gostaria. Ouvi muitas vezes vocês falarem, uns com os outros, “deixa o papai estudar”. Os filhos são herança do Senhor, então eu sou muito rico. Ao meu saudoso, querido e amado pai (muitas lágrimas, de saudade e de alegria por ter sido filho de um homem tão especial), Edelto Barreto Antunes, por ter, sempre, caminhado mais uma milha comigo. Ele, juntamente com minha mãe, a quem também agradeço, nunca mediu esforço para que eu pudesse crescer como homem, profissional, chefe de família e servo de Deus. Aos meus irmãos (Edelto, Flávio e Lisandro, este último se tornou meu irmão através da vontade de Deus), minhas cunhadas, sobrinhos (as), tios (as), primos (as), sogro, sogra, cunhado, por me apoiarem e pelas orações. Aos meus orientadores Professora Doutora Isabela das Neves Rôças Siqueira e Professor Doutor José Freitas Siqueira Júnior pelo exemplo de competência

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e dedicação, pela paciência, confiança, amizade e pela oportunidade de realizar trabalhos com vocês. Tem sido muito gratificante conviver e aprender com dois grandes nomes mundiais da endodontia, mas também pude enxergar nos meus orientadores muitos exemplos de uma vida conjugal, isto mesmo, conjugal bem ajustada. Espero que possamos produzir muitos trabalhos científicos juntos e me esforçarei para estar à altura desta parceria. Ao amigo, mestre, Doutor de quem tenho a honra de falar que sou discípulo, Edson Jorge Lima Moreira. Seus conhecimentos, sua sabedoria, sua disposição de ensinar, sua competência e seriedade me fizeram notar que a endodontia deve ser realizada seguindo princípios e que ensinar endodontia, é uma imensa responsabilidade, mas também é um prazer inconteste. À querida Angélica Pedrosa por sua paciência, por sua forma gostosa de me tratar, como se fosse minha mãe e pelas inúmeras vezes que me socorreu, de forma tão competente e carinhosa. Ao Professor Doutor Flávio Rodrigues Ferreira Alves por estar sempre pronto a ensinar e por ter participado diretamente deste trabalho. Aos Professores do PPGO (Doutor Fábio Ramoa, Doutor Fábio Vidal, Doutor José Cláudio Provenzano, Doutora Mônica Aparecida Schultz Neves, Doutora Luciana Armada Dias, Doutor Lúcio Gonçalves) pelos ensinamentos, dedicação e oportunidade de aprendizado. Aos amigos que conheci no PPGO (Carlos Vieira, Mariana Maneschy, Nilton Dessaune, Cristiane Alfenas, Júlio César e Fernanda) pelos momentos de companheirismo, pelos momentos de profundo aprendizado e troca de v

conhecimento, mas também pelos momentos de descontração que passamos juntos. Esta amizade não acabará aqui. Já agradeci a ele, mas preciso fazer um destaque ao meu amigo que se tornou um irmão no decorrer desse tempo que passamos juntos, seja no PPGO, como em minha casa e na sua casa. Carlos Vieira, agradeço muito pela grande ajuda que me deu, neste e em outros trabalhos, pelas conversas profissionais e pessoais que tivemos. À Renata Val pela amizade, ajuda e parceria. Tive o prazer de trabalhar e de aprender com você. Aos meus amigos e colegas de trabalho na UNIGRANRIO, Ricardo Carvalho, Oswaldo Fonseca, Thais Accorsi, Katiana Vidal, Gustavo de Deus e Victor Talaricco, pela ajuda no decorrer do meu curso, me permitindo estar ausente em algumas ocasiões. Ao amigo e colega de trabalho Doutor Emmanuel Nogueira, pela grande ajuda na revisão do meu trabalho. Ao técnico Marlei, pelo apoio excepcional durante o trabalho laboratorial.

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ÍNDICE _______________________________________________________________

Página

RESUMO.............................................................................................

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ABSTRACT.........................................................................................

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LISTA DE ABREVIATURAS...............................................................

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1- INTRODUÇÃO...............................................................................

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2- REVISÃO DE LITERATURA.........................................................

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3- JUSTIFICATIVA.............................................................................

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4- HIPÓTESE.....................................................................................

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5- OBJETIVOS ..................................................................................

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6- ARTIGO PUBLICADO...................................................................

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7- DISCUSSÃO.................................................................................

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8- CONCLUSÕES.............................................................................

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9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................

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10- ANEXOS......................................................................................

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RESUMO _______________________________________________________________ Objetivos: Neste estudo, foi realizada a quantificação da carga bacteriana total e a identificação da presença, níveis e abundância relativa de diversos patógenos endodônticos, exclusivamente na porção apical do sistema de canais radiculares, de dentes com lesão pós-tratamento. Materiais e Métodos: 27 fragmentos apicais de dentes com tratamento endodôntico radiograficamente adequados foram obtidos durante cirurgia perirradicular e pulverizados criogenicamente. DNA foi extraído a partir do pó e o método da reação em cadeia da polimerase em tempo real foi utilizado para identificar e quantificar as bactérias totais e sete espécies ou grupos bacterianos. Resultados: Bactérias foram detectadas em 21/27 espécimes. Streptococcus spp. foi o grupo mais prevalente (76%), seguido por membros do filo Actinobacteria (52%) e a espécie Pseudoramibacter alactolyticus (19%). A média da carga bacteriana total nos fragmentos apicais foi de 5,7 × 10⁴ células por ápice (ou 2,1 × 10⁴/100mg do pó). Streptococcus spp. representaram de 0,02% a 99,9% do total da contagem bacteriana, Actinobacteria de 0,02% a 84,7%, e P. alactolyticus de 67,9% a 99%. Enterococcus faecalis foi encontrado em apenas três (14%) casos, dos quais foi dominante em dois. Conclusões: Membros do gênero Streptococcus e do filo Actinobacteria, assim como a espécie P. alactolyticus foram os mais prevalentes na região apical do sistema de canais e dominaram a população bacteriana em muitos casos. Isto sugere participação importante na patogênese de lesões pós-tratamento. Palavras-chave: gene do 16S rRNA; retratamento; lesão perirradicular póstratamento; reação em cadeia da polimerase em tempo real.

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ABSTRACT _______________________________________________________________ Aim: This study was designed to evaluate the total bacterial counts and the presence, levels and relative abundance of candidate endodontic pathogens exclusively in the apical root canal system associated with post-treatment apical periodontitis. Materials and Methods: Apical root specimens obtained during periradicular surgery of 27 adequately treated teeth with persistent apical periodontitis were cryogenically ground. DNA was extracted from the powder and real-time polymerase chain reaction was used to quantify total bacteria and seven bacterial taxa. Results: Samples from 21 teeth were positive for bacteria. Streptococcus species were the most prevalent (76%), followed by members of the Actinobacteria phylum (52%) and Pseudoramibacter alactolyticus (19%). The mean total bacterial load in the apical root segments was 5.7 × 104 cell equivalents per root apex (or 2.1 × 104/100mg of root powder). Streptococci comprised from 0.02% to 99.9% of the total bacterial counts, actinobacteria from 0.02% to 84.7%, and P. alactolyticus from 67.9 to 99%. Although Enterococcus faecalis was found in only 3 (14%) cases, it was dominant in 2. Conclusions: Streptococcus species, members of the Actinobacteria phylum and P. alactolyticus were the most prevalent taxa in the apical canal system and dominated the bacterial populations in many cases of post-treatment apical periodontitis. Key words: 16S rRNA gene; root canal-treated teeth; post-treatment apical periodontitis; quantitative real-time polymerase chain reaction.

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LISTA DE ABREVIATURAS

PCR - Reação em cadeia da polimerase SCR – Sistema de canais radiculares TE- Tris EDTA TCFC – Tomografia computadorizada de feixe cônico DNA – Ácido desoxirribonucleico

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1. INTRODUCÃO

A lesão perirradicular, também denominada periodontite apical ou lesão periapical, é uma doença inflamatória que surge como resposta a uma infecção intrarradicular e representa a doença a ser tratada ou prevenida pelo endodontista (ANDERSON et al., 2013; SIQUEIRA et al., 2014). Ela pode ser classificada como primária ou pós-tratamento, sendo esta última causada principalmente

por

infecções

persistentes

ou

secundárias,

que

são

caracterizadas por possuírem uma menor diversidade microbiana, quando comparadas à infecção primária (NAIR, 2006; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009b). A infecção secundária acontece após a intervenção do profissional, sendo os micro-organismos introduzidos no canal durante ou após o tratamento endodôntico. Já a infecção persistente se dá em virtude da não eliminação, durante a terapia endodôntica, dos micro-organismos que estavam presentes na infecção primária ou secundária e que de alguma maneira resistiram ao preparo químico-mecânico realizado durante o tratamento endodôntico (SIQUEIRA, 2002). A permanência microbiana e o consequente insucesso da terapia endodôntica estão também associados a complexidades anatômicas, incluindo túbulos dentinários, canais laterais, istmos e outras irregularidades do sistema de canais radiculares (SCR) (KISHEN, 2010; RICUCCI & SIQUEIRA, 2011; VIEIRA et al., 2012). A complexa anatomia dos canais radiculares dificulta a coleta de amostra para estudos microbiológicos por meio de cones de papel estéril, por

1

não

atingir

áreas

do

SCR

que

podem

abrigar

micro-organismos.

Consequentemente, algumas espécies bacterianas relacionadas ao fracasso endodôntico possivelmente ainda não foram identificadas. Com o objetivo de superar esta limitação metodológica, tem sido recomendada uma abordagem diferente, ou seja, a pulverização criogênica de fragmentos radiculares, removidos durante cirurgias perirradiculares ou após exodontias, seguido pela utilização de métodos moleculares para analisar o DNA extraído a partir do pó gerado por esta técnica (ALVES et al., 2009; RÔÇAS et al., 2010). Não há estudos prévios na literatura utilizando o método de criopulverização seguido de métodos moleculares para a identificação e quantificação dos principais patógenos endodônticos na região apical de dentes

com

tratamento

endodôntico

adequado

associados

a

lesão

perirradicular. A possibilidade de aumentar o conhecimento sobre a microbiota, de dentes tratados endodonticamente, associada à lesão perirradicular, permitirá uma

maior

compreensão

da

doença

e

criará

perspectivas

para

o

estabelecimento de novos protocolos de prevenção (durante o tratamento) e de correção (durante o retratamento ou cirurgia) do problema.

2

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Infecção Endodôntica O papel dos micro-organismos na etiologia das lesões perirradiculares foi inicialmente descrito por MILLER (1864) e confirmado por KAKEHASHI et al. (1965). Utilizando um modelo experimental em ratos, estes últimos autores observaram que ratos germ-free com polpas expostas à cavidade oral não desenvolviam lesão perirradicular, enquanto que os ratos convencionais apresentavam lesões após a exposição da polpa à cavidade oral. Inúmeros outros trabalhos foram publicados posteriormente confirmando esta relação entre as lesões perirradiculares e a infecção do canal radicular (SUNDQVIST, 1976; BYSTROM & SUNDQVIST, 1981; MÖLLER et al., 1981; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; SAKAMOTO et al., 2006; RÔÇAS et al., 2008). A infecção endodôntica tem como principal causa a cárie dentária (WARFVINGE & BERGENHOLTZ, 1986; FALKER et al., 1987). Quando microorganismos presentes na lesão cariosa penetram na dentina, começam a acontecer alterações pulpares que se intensificam à medida que o processo carioso avança, fazendo com que a resposta inflamatória da polpa seja cada vez maior (REEVES & STANLEY, 1966; TROWBRIDGE, 2009). Diante do conhecimento dessa dinâmica pode-se entender que, em um primeiro momento, os micro-organismos que irão colonizar o SCR são sacarolíticos e geralmente anaeróbios facultativos. Com o passar do tempo, o avanço da infecção em direção ao ápice radicular e o contato dos microorganismos com os fluidos provenientes da região perirradicular, espécies

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anaeróbias estritas e proteolíticas passam a predominar (FABRICIUS et al., 1982; FIGDOR & SUNDQVIST, 2007). As

infecções

endodônticas

são

comumente

classificadas

em

intrarradicular e extrarradicular. As infecções extrarradiculares podem ser dependentes ou independentes da intrarradicular e não são muito comuns. Geralmente as infecções extrarradiculares são uma continuação das intrarradiculares, sendo o abscesso perirradicular agudo o principal exemplo destas (SIQUEIRA, 2002; RICUCCI et al., 2015). As infecções intrarradiculares podem ser divididas em primária, secundária e persistente. As infecções primárias são aquelas em que ainda não houve a intervenção do profissional, também chamada de infecção inicial (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009a; HONG et al., 2013). Neste tipo de infecção pode-se encontrar de dez a vinte espécies bacterianas (MUNSON et al., 2002; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005a), com um número variando de 103 a 108 células, compondo uma infecção polimicrobiana, com predomínio de bactérias anaeróbias estritas, principalmente proteolíticas (BLOME et al., 2008). As infecções intrarradiculares secundárias e persistentes são os principais agentes etiológicos dos fracassos endodônticos. Essas infecções geralmente são indistinguíveis clinicamente e são conhecidas como as principais causas de flare-ups entre as sessões de tratamento e da persistência de exsudato e sintomatologia. A infecção endodôntica secundária é causada por micro-organismos que não estavam presentes na infecção primária, mas foram introduzidos no canal em algum momento após a intervenção do profissional (SIQUEIRA, 2002). A infecção endodôntica persistente é causada por micro-organismos que participaram das infecções primária ou secundária e

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de alguma maneira conseguiram resistir à terapia endodôntica e suportaram períodos de privação de nutrientes (SIQUEIRA et al., 2014). Nos dentes com lesão pós-tratamento, pode-se encontrar de uma a cinco espécies em casos de tratamentos adequados e de duas a trinta espécies em casos de tratamentos inadequados. O número pode variar de 103 a 107 células bacterianas, sendo também caracterizadas por infecções polimicrobianas, mas com menos espécies que as infecções primárias (MUNSON et al., 2002; BLOME et al., 2008). As populações microbianas são provenientes da proliferação dos microorganismos, podendo interagir entre si e formar comunidades aderidas a um substrato, conhecidas como biofilmes. Biofilme bacteriano pode ser definido como uma comunidade microbiana multicelular séssil caracterizada por células firmemente aderidas a uma superfície e embebidas em uma matriz extracelular polimérica produzida pelos próprios membros da comunidade (DONLAN & COSTERTON, 2002). Biofilmes têm a capacidade de suportar e enfrentar as condições ambientais, permitindo a sobrevivência e o crescimento dos microorganismos

que

os

compõem.

Tornou-se

claro

que

nas

infecções

polimicrobianas, o todo é muito maior do que a simples soma de suas partes e cada componente tem que ser entendido em sua relação com outros membros da comunidade (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009a). As bactérias vivem em comunidades e tem um comportamento coletivo, interagindo e se comunicando umas com as outras, através de um fenômeno de intercomunicação intracelular (intra e interespécies) – o sistema quorum sensing (MILLER & BASSLER, 2001). Este sistema regula a virulência, produção metabólica secundária e formação de biofilme bacteriano (PARSEK & GREENBERG, 2005). Em

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situações adversas, todo esse sistema regulador atrasa a produção de fatores de virulência, reduz a atividade metabólica até que a comunidade atinja um número de células suficiente para assegurar que a secreção de fatores de virulência irá resultar em uma infecção que gere danos ao hospedeiro (BASSLER, 1999; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009a). Alguns estudos definiram que uma doença causada por biofilme preenche os seguintes critérios: apresenta bactérias aderidas ou associadas a uma superfície; o tecido infectado contém bactérias formando microcolônias embebidas em matriz extracelular; a infecção é confinada a um sítio específico e a disseminação é um evento secundário; a infecção é difícil ou impossível de erradicar com antibióticos usados sistemicamente; as defesas do hospedeiro são ineficazes na eliminação bacteriana; a eliminação ou desorganização da estrutura e ecologia do biofilme leva à remissão da doença (PARSEK & SINGH, 2003; HALL-STOODLEY & STOODLEY, 2009; RICUCCI & SIQUEIRA, 2010). Baseado nestes critérios, a lesão perirradicular pode ser incluída na lista de doenças causadas ou fortemente associadas a biofilmes bacterianos (RICUCCI & SIQUEIRA, 2010).

2.2. Fracasso Endodôntico Para entender o fracasso endodôntico é importante compreender o sucesso. De acordo com o dicionário Oxford da língua inglesa, sucesso pode ser definido como quando são alcançados os objetivos ou o que se pretende. O objetivo do endodontista é prevenir a lesão perirradicular quando esta está ausente ou tratá-la, quando presente (SIQUEIRA, 2011).

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Em endodontia, o sucesso pode ser determinado pelos métodos histológicos, radiográficos e clínicos. Histologicamente, considera-se sucesso quando não há inflamação nos tecidos perirradiculares. Os achados na literatura são um pouco divergentes, variando a taxa de sucesso histológico entre 7% a 49% (BRYNOLF, 1967; GREEN et al., 1997; BARTHEL et al., 2004).

Embora

os

critérios

histológicos

permitam

uma

visualização

microscópica do que está de fato acontecendo nos tecidos afetados, tal avaliação não pode ser aplicada na rotina clínica, uma vez que demanda a remoção cirúrgica dos tecidos. Radiograficamente, uma lesão pode desaparecer em um período de um a quatro anos, sendo que estudos epidemiológicos revelam índices de sucesso que variam de 64%, entre os clínicos gerais, a 95%, entre os especialistas (ERIKSEN, 1991; WEIGNER et al., 1998; ERIKSEN et al., 2002). A permanência da lesão do mesmo tamanho ou o seu aumento em um período de dois anos pode ser considerado fracasso. Na maioria dos casos em que as lesões diminuem num período de um a dois anos, esta diminuição irá continuar até o completo desaparecimento. Porém, se esse completo desaparecimento não acontecer, será considerado fracasso, podendo esta diminuição do tamanho da lesão ser explicada pela simples redução, mas sem completa eliminação ou controle eficaz da carga microbiana (FRIEDMAN, 2008). Clinicamente, considera-se sucesso quando o dente está em função, sem sintomatologia, sem fístula, sem tumefação e ausência ou diminuição de rarefação óssea perirradicular (ESTRELA et al., 2014a; ESTRELA et al., 2014b). Não pode ser considerada como sucesso a permanência de uma

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lesão, já que entende-se que o objetivo do tratamento endodôntico é prevenir ou tratar a doença perirradicular (JANG et al., 2015). A ausência de sinais e sintomas e ausência de imagem radiográfica são os principais fatores considerados para definir o resultado do tratamento endodôntico (FRIEDMAN, 2008). As lesões perirradiculares presentes em decorrência de fracassos no tratamento endodôntico podem ser emergentes, quando aparecem após o tratamento, persistentes, quando permanecem a despeito do tratamento e recorrentes, quando desaparecem e após um tempo, tornam a aparecer (SIQUEIRA et al., 2014). As infecções persistentes são as principais causas das lesões perirradiculares persistentes, enquanto as infecções secundárias são provavelmente a principal causa das lesões perirradiculares emergentes assim como, das lesões recorrentes (VIEIRA et al., 2012). Para uma melhor compreensão dos objetivos a serem alcançados no tratamento endodôntico de dentes com lesões perirradiculares é importante levar em conta a observação clássica de SMITH (1934), de que a doença depende do número de micro-organismos multiplicado pela virulência dos mesmos e divididos pela resposta do hospedeiro. De acordo com esta teoria, se o nível bacteriano estiver abaixo de um determinado limiar a doença não existirá. Porém, se por algum motivo houver o aumento desse nível bacteriano, automaticamente a lesão perirradicular aparecerá. Sabe-se que o objetivo ideal para o tratamento endodôntico é a esterilização do SCR. Como este objetivo não é possível através das técnicas atuais de desinfecção, o tratamento visa uma redução bacteriana a níveis máximos compatíveis com a cura perirradicular (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2007; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008).

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O fracasso do tratamento endodôntico normalmente ocorre quando os procedimentos de desinfecção não alcançam níveis satisfatórios para prevenir ou controlar a infecção endodôntica (RAY & TROPE, 1995; GEORGOPOULOU et al., 2008; RÔÇAS et al., 2008). Portanto, é possível entender claramente que dentes com tratamento endodôntico radiograficamente adequado podem falhar no objetivo de prevenir ou erradicar a lesão perirradicular, já que a infecção endodôntica pode não ter sido controlada eficazmente. Estudos revelam que a microbiota do canal radicular do dente tratado endodonticamente

associado

à

lesão

perirradicular

persistente

difere

substancialmente da microbiota de dentes com polpas necrosadas e não tratados (HONG et al., 2013; TZANETAKIS et al., 2015). A microbiota dos canais com fracasso endodôntico é composta por um número bastante limitado de espécies bacterianas, que podem se apresentar mais resistentes aos métodos de combate à infecção utilizados na endodontia (HONG et al., 2013; KARYGIANNI et al., 2015). Independente da qualidade do tratamento endodôntico, a causa do fracasso está basicamente relacionada a bactérias normalmente envolvidas na infecção intrarradicular secundária ou persistente e algumas vezes na infecção extrarradicular. Obviamente, dentes com tratamentos endodônticos realizados de forma insatisfatória têm maior chance de insucesso do que aqueles dentes que foram submetidos a tratamentos endodônticos adequados (SIQUEIRA, 2011). Raramente, a etiologia será não microbiana e quando isso acontece, as causas podem ser diversas como sugerido por KOPPANG et al. (1989), que identificaram fibras de celulose dos cones de papel absorvente como possíveis causadoras de lesões perirradiculares persistentes. NAIR (1999) sugeriu que

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cristais de colesterol poderiam favorecer uma resposta óssea inflamatória e contribuir para a manutenção da inflamação na região perirradicular mesmo na ausência de infecção concomitante. No entanto, não existe ainda comprovação suficiente do papel de fatores não microbianos na indução de lesões perirradiculares persistentes (SIQUEIRA et al. 2014). Existe a possibilidade da origem de uma lesão óssea com imagem radiográfica próxima à região perirradicular não ser endodôntica. De acordo com KONTOGIANNIS et al. (2015), em um estudo onde avaliaram 1521 biopsias, a ocorrência de lesões de origem não endodôntica é de apenas 3,4%, sendo o ceratocisto odontogênico o mais prevalente nesses casos. A infecção está presente em praticamente todos os casos de fracasso. RICUCCI et al. (2013) observaram bactérias presentes nos túbulos dentinários e canais acessórios de um dente bem tratado. VIEIRA et al. (2012) encontraram bactérias nos túbulos dentinários, em um caso de lesão recorrente após doze anos de sucesso aparente. Segundo os autores, a dissolução do cimento endodôntico e o contato dos fluidos teciduais com bactérias, que permaneceram em estado de privação de nutrientes por todos esses anos, a provável causa desse reaparecimento da lesão. RICUCCI et al. (2009) avaliaram histologicamente 24 dentes tratados endodonticamente com lesão perirradicular (doze assintomáticos e doze sintomáticos), que foram extraídos ou sujeitos à apicectomia. Bactérias foram identificadas em todos os casos, exceto em um dente assintomático, no qual existia extrusão de material obturador. As bactérias foram encontradas na porção apical do SCR, principalmente nas ramificações, canais laterais, istmos e túbulos dentinários.

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Alguns estudos mostram que, a presença de bactérias que foram capazes de sobreviver aos procedimentos de desinfecção e permaneceram no momento da obturação influencia significativamente o resultado do tratamento endodôntico (ENGSTRÖM et al., 1964; SJÖGREN et al., 1997). Tal persistência pode ser explicada pela dificuldade imposta pela anatomia do SCR e pela resistência do biofilme bacteriano. Bactérias apresentam inúmeras estratégias para resistir ao tratamento. Estes micro-organismos podem aderirse às paredes dos canais e se acumular sob a forma de biofilme, ou estarem localizados em áreas inacessíveis aos instrumentos e às substâncias químicas utilizadas no tratamento (DISTEL et al., 2002; NAIR et al., 2005; CARR et al., 2009; RICUCCI et al., 2009; ARNOLD et al., 2013). Além disso, podem se adaptar às condições de redução drástica de nutrientes e permanecerem assim até que consigam novamente substrato para sua proliferação (LIN et al.,1992; PINHEIRO et al., 2003; GOMES et al., 2008; RÔÇAS et al., 2008). Nas infecções persistentes há maior prevalência de bactérias Grampositivas facultativas, sendo caracterizada principalmente pela presença de Enterococcus faecalis e espécies de Streptococcus. A espécie E. faecalis tem sido encontrada com frequência em dentes com fracasso endodôntico e lesão persistente (SUNDQVIST et al., 1998; PINHEIRO et al., 2003; RÔÇAS et al., 2004; ZERELLA et al., 2005; SEDGLEY et al., 2006; GOMES et al., 2008; RÔÇAS et al., 2008; TENNERT et al., 2014). O E. faecalis, assim como a Candida albicans, esta um fungo, podem ser resistentes à medicação intracanal, inclusive ao hidróxido de cálcio (BYSTRÖM et al., 1985; WALTIMO et al., 1999). Contudo, a condição do E. faecalis como principal agente causador de fracassos endodônticos (PORTENIER et al., 2003) tem sido

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questionada atualmente em vários estudos em função de que, quando está presente, esta raramente é uma das espécies dominantes na microbiota associada a casos de retratamento (RÔÇAS et al., 2004; RÔÇAS et al., 2008; SAKAMOTO et al., 2008). Além disso, apesar de ser facilmente cultivado, o E. faecalis não é detectado em todos os casos que avaliam dentes com lesões perirradiculares (CHEUNG & HO, 2001; ROLPH et al., 2001) e sua prevalência não difere em dentes com ou sem lesão (KAUFMAN et al., 2005; ZOLETTI et al., 2006). Estreptococos e muitas espécies anaeróbias também têm sido encontradas,

incluindo

Pseudoramibacter

Propionibacterium

alactolyticus,

e

propionicum,

espécies

dos

Filifactor

gêneros

alocis,

Dialister

e

Actinomyces, geralmente compondo uma comunidade mista (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; RÔÇAS et al., 2008; SAKAMOTO et al., 2008; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). A grande maioria dos estudos que tratam da microbiota de dentes com fracasso endodôntico e lesão perirradicular estão restritos a análises de prevalência. A relevância patogênica e ecológica de uma determinada espécie no processo da doença também se relaciona com suas contagens absolutas e abundância relativa em relação à comunidade bacteriana total (CHEUNG & HO, 2001; ROLPH et al., 2001; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; RÔÇAS et al., 2008; SAKAMOTO et al., 2008; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). Parece evidente que dentes com tratamento endodôntico inadequado e com condições propícias de acesso coronário são bons candidatos para o retratamento endodôntico. No entanto, canais bem tratados, nos quais o retratamento não oferece melhor prognóstico que o tratamento, casos em que

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o acesso coronário não é possível ou com risco de acidentes (fratura radicular na tentativa de remoção de um núcleo intrarradicular) e condições que exigem biópsia são indicações para a cirurgia perirradicular (SIQUEIRA et al., 2014). Além desses fatores, a cirurgia está indicada se, após um período mínimo de um ano de acompanhamento, a lesão perirradicular permanecer com a imagem radiográfica do mesmo tamanho quando comparada ao exame realizado logo após a intervenção, ou se tiver aumentado, bem como se aparecer uma lesão emergente (WU et al., 2006).

2.3. Métodos moleculares É essencial identificar as principais espécies bacterianas envolvidas nos fracassos endodônticos (RÔÇAS & SIQUEIRA, 2010). Inúmeros trabalhos têm sido realizados com a finalidade de identificar as espécies microbianas envolvidas na infecção endodôntica, sendo a maior parte desses se baseia em métodos de cultura (SUNDQVIST et al., 1998; PINHEIRO et al., 2003). Estes métodos apresentam algumas limitações quando se trata de diagnóstico microbiológico, como baixa sensibilidade, erro na identificação de certas espécies cultiváveis com fenótipo ambíguo, dificuldade na detecção de espécies de difícil cultivo e incapacidade de crescimento de muitas espécies orais nas condições artificiais de laboratório (RÔÇAS & SIQUEIRA, 2011). Nos últimos anos, têm ocorrido avanços significativos nos estudos da microbiota endodôntica, com a utilização de métodos moleculares como o checkerboard para hibridização DNA-DNA e a reação em cadeia da polimerase (PCR) e os seus derivados (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005b; MURAD et al., 2014; ROSA et al., 2015).

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A utilização de métodos moleculares tem permitido não só a confirmação da associação de diversas bactérias já identificadas pelos métodos de cultura, mas também tem incluído inúmeras espécies de difícil cultivo ou até mesmo não cultiváveis na lista de patógenos endodônticos putativos. Esta lista tem se expandido de forma considerável com a inserção dos métodos moleculares na busca de um melhor conhecimento da infecção endodôntica (MUNSON et al., 2002; TANG et al., 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005a; SEDGLEY et al., 2006; WILLIAMS et al., 2006; SIQUEIRA et al., 2007; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2011). O impacto destes métodos no conhecimento da microbiota bucal em condições saudáveis e doentes, assim como da microbiota endodôntica, é surpreendente e inconteste (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005a). Bactérias que persistem após o tratamento endodôntico estão usualmente localizadas nas irregularidades das paredes do canal principal ou em áreas como canais laterais, ramificações apicais, túbulos dentinários e istmos (NAIR et al., 2005; RICUCCI et al., 2009; VERA et al., 2012). Na maioria dessas áreas, as bactérias são inacessíveis aos instrumentos endodônticos e às substâncias utilizadas no tratamento. Da mesma forma, procedimentos de coleta microbiológica convencionais usando cones de papel, também não alcançam essas áreas, e consequentemente, espécies bacterianas envolvidas com o fracasso endodôntico não são coletadas e identificadas (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004). Com a possibilidade de importantes patógenos endodônticos passarem despercebidos pela coleta convencional, uma abordagem diferente tem sido recomendada. Esta consiste em uma pulverização (trituração) da raiz utilizando um moinho criogênico, com posterior utilização de métodos moleculares para

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analisar o DNA extraído, a partir do pó dentinário produzido durante a pulverização (RÔÇAS et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2011). TRAN et al. (2013) realizaram a pulverização criogênica manualmente com gral e pistilo e compararam com a coleta bacteriológica utilizando cones de papel. Os resultados mostraram que a coleta com cones de papel foi significativamente inferior à pulverização criogênica na recuperação de bactérias das amostras. ALVES et al. (2009) realizaram a pulverização criogênica de fragmentos dos terços apical e médio/coronário de dentes recém-extraídos para comparar o perfil genético da comunidade bacteriana nestes segmentos. Os dentes estudados apresentavam evidências de infecção endodôntica primária. Os resultados demonstraram que o perfil da comunidade bacteriana do terço apical é tão diverso, quanto o da porção média/coronária, porém, um número muito maior de espécies foi detectada em comparação com estudos prévios usando cones de papel para coleta (TANG et al., 2004; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005a; SEDGLEY et al., 2006; WILLIAMS et al., 2006; SIQUEIRA et al., 2007; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2011). Estes estudos demonstraram que a utilização da pulverização criogênica na avaliação da microbiota endodôntica é eficaz e permite verificar o SCR em sua totalidade. Porém, apesar deste método permitir uma avaliação mais completa apenas é aplicável em dentes extraídos ou em ápices que foram coletados após apicectomia (TZANETAKIS et al., 2015). Outra dificuldade apresentada é a necessidade de uma descontaminação da superfície externa do fragmento radicular com a finalidade de permitir que a coleta microbiana seja realizada apenas no SCR, já que existe a possibilidade de uma contaminação da superfície externa da raiz por micro-organismos provenientes

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da saliva ou do sulco gengival, durante a extração ou cirurgia perirradicular (RÔÇAS et al., 2010; ÖZOK et al., 2012). Os avanços recentes na identificação por métodos moleculares associados ou não com a pulverização criogênica têm alterado de forma significativa a compreensão do fracasso endodôntico e permitido uma visão mais ampla dessa complexa microbiota associada às infecções endodônticas (ZEHNDER & BELIBASAKIS, 2015).

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3. JUSTIFICATIVA _______________________________________________________________

Não há estudos prévios na literatura utilizando o método de criopulverização seguido de métodos moleculares para identificação e quantificação dos principais patógenos endodônticos na região apical de dentes com tratamento endodôntico adequado e com lesão perirradicular.

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4. HIPÓTESE

A identificação e a quantificação de bactérias presentes no terço apical em dentes bem tratados endodonticamente e com lesões perirradiculares associadas podem ser mais acuradas utilizando-se espécimes criopulverizados e submetidos à análise pelo método molecular PCR em tempo real, quando comparado aos métodos convencionais.

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5. OBJETIVOS

Avaliar a contagem total de bactérias, assim como a presença, níveis e abundância relativa de diversos patógenos endodônticos na porção apical do SCR em dentes com tratamento endodôntico adequado associados a lesão perirradicular.

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6. ARTIGO PUBLICADO

Antunes HS, Rôças IN, Alves FR, Siqueira JF Jr (2015). Total and specific bacterial levels in the apical root canal system of teeth with post-treatment apical periodontitis. J Endod 41: 1037-1042.

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7. DISCUSSÃO

Este estudo clínico quantificou os níveis de bactérias totais e de diferentes patógenos endodônticos no terço apical do SCR de dentes com tratamento endodôntico radiograficamente adequado e portadores de lesão perirradicular. Considerando-se que as bactérias localizadas no terço apical do canal radicular estão em posição estratégica para causar danos ao hospedeiro e perpetuar uma lesão perirradicular, é curioso o fato de não existirem muitos estudos sobre a microbiota apenas dessa região. Estudos morfológicos têm mostrado a localização bacteriana em casos de insucesso endodôntico (CARR et al., 2009; RICUCCI et al., 2009; ARNOLD et al., 2013), porém, não fornecem informações sobre a identificação e quantificação bacteriana nesses casos. A maioria dos estudos sobre a microbiota especificamente do terço apical avaliaram dentes com infecções intrarradiculares primárias (BAUMGARTNER & FALKLER, 1991; SIQUEIRA et al., 2004; ALVES et al., 2009; SIQUEIRA et al., 2009; RÔÇAS et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2011; ÖZOK et al., 2012). Apenas

alguns

poucos

estudos

avaliaram

casos

de

infecções

persistentes ou secundárias em dentes tratados endodonticamente associados com lesão pós-tratamento (SUBRAMANIAN & MICKEL, 2009; CHUGAL et al., 2011; WANG et al., 2012). Destes, dois analisaram os segmentos apicais obtidos durante cirurgia perirradicular, nos quais as bactérias foram coletadas após agitação e centrifugação dos ápices (SUBRAMANIAN & MICKEL, 2009; WANG et al., 2012). No outro estudo, a coleta das amostras foi realizada no terço apical de dentes extraídos, utilizando-se instrumentos endodônticos e pontas de papel absorventes (CHUGAL et al., 2011). No método de coleta

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convencional usando cones de papel absorvente estéril somente as bactérias localizadas no canal principal e na dentina adjacente são coletadas e detectadas impedindo a avaliação de bactérias presentes no interior dos túbulos dentinários, ramificações, istmos e irregularidades Neste estudo, foi utilizada a pulverização criogênica dos fragmentos apicais coletados durante cirurgia perirradicular, sendo assim, possível incorporar para análise todas as bactérias presentes na complexa anatomia do SCR. Usando essa abordagem, uma amostra muito mais representativa pode ser obtida. Um estudo confirmou que a pulverização fornece resultados superiores quando comparado a coleta com pontas de papel absorvente para a detecção bacteriana (TRAN et al., 2013). Além disso, essa metodologia permitiu que apenas as bactérias presentes no terço apical do SCR fossem avaliadas. A principal desvantagem da pulverização criogênica está no fato de só poder ser realizada em dentes com indicação de cirurgias perirradiculares ou extração (TZANETAKIS et al., 2015), não podendo ser usada para acompanhar longitudinalmente os casos, como por exemplo, verificar a eliminação bacteriana após o retratamento. Além disso, é de suma importância que seja realizada a desinfecção cuidadosa da superfície externa da raiz, para eliminar contaminações externas e evitar resultados falso positivos (RÔÇAS et al., 2010; ÖZOK et al., 2012).

Neste estudo foi realizado um controle da

descontaminação da superfície externa ao esfregar, em cada fragmento, um cone de papel absorvente estéril, número 80, embebido com solução tampão Tris EDTA (TE). A análise por PCR em tempo real apresentou resultados

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negativos confirmando que o protocolo de desinfecção foi executado com sucesso. É importante salientar que essa abordagem pode ter eliminado bactérias que constituem o biofilme extrarradicular, ou seja, possíveis causas da doença perirradicular pós-tratamento.

Levando em conta os risco de detecção de

contaminantes caso a desinfecção radicular externa não fosse adequadamente realizada e considerando que o biofilme extrarradicular não é muito comum (RICUCCI et al., 2009), optamos por analisar apenas a microbiota intrarradicular desses dentes. Vários estudos têm demonstrado que a microbiota relacionada ao fracasso

de

dentes

com

tratamento

endodôntico

adequado

difere

substancialmente da microbiota de dentes com infecção primária ou de dentes com tratamento endodôntico inadequado (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009b; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009c; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012; HONG et al., 2013; TZANETAKIS et al., 2015). A infecção primária se caracteriza por ser uma infecção polimicrobiana, tendo um certo equilíbrio entre bactérias Grampositivas e Gram-negativas, com predomínio de bactérias anaeróbias estritas, principalmente proteolíticas (FIDGOR & SUNDQVIST, 2007; BLOME et al., 2008). Na infecção relacionada aos casos de fracasso endodôntico encontra-se uma menor diversidade bacteriana, aparentemente sem um predomínio de anaeróbios estritos ou facultativos (RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012; HONG et al., 2013; TZANETAKIS et al., 2015). Inúmeros estudos têm revelado que bactérias Gram-positivas são encontradas com mais frequência nos casos de fracasso (RÔÇAS et al., 2004; ZERELLA et al., 2005; SEDGLEY et al., 2006; GOMES et al., 2008; SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA, 2011; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012;

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HONG et al., 2013; TENNERT et al., 2014; KARYGIANNI et al., 2015; TZANETAKIS et al., 2015). Tal fato sugere que estes micro-organismos podem ser mais resistentes aos procedimentos antimicrobianos realizados durante a terapia endodôntica e portanto capazes de se adaptarem às condições ecológicas dos canais radiculares tratados (RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). O fato do tratamento endodôntico estar radiograficamente adequado sugere que a instrumentação do canal foi devidamente realizada. Porém, alguns poucos micro-organismos são capazes de sobreviver às condições de escassez de nutrientes geradas pelos procedimentos realizados durante a terapia endodôntica, ou estão presentes em áreas que não são afetadas pelo tratamento, já que a anatomia do SCR é bastante complexa, podendo possuir inúmeras ramificações, istmos, além dos túbulos dentinários (VIEIRA et al., 2012; ARNOLD et al., 2013). Sendo assim, para identificar os micro-organismos que compõem a microbiota persistente em casos de fracassos endodônticos, todos os ápices avaliados neste estudo foram removidos de dentes que possuíam tratamentos endodônticos julgados adequados (como determinado através de exame radiográfico e de tomografia computadorizada por feixe cônico (TCFC)) e associados à lesão perirradicular pós-tratamento. Neste trabalho, o período mínimo de acompanhamento para determinar o insucesso foi de um ano, pois estudos têm demonstrado que nos casos de sucesso, o desaparecimento ou pelo menos a diminuição da lesão poderá ser notada em um período de um a dois anos. As lesões que não diminuem ou que aumentam neste prazo, geralmente resultam em fracasso (WEIGNER et al., 1998; ERIKSEN et al., 2002; FRIEDMAN, 2008).

30

Não foi possível avaliar se as medidas de assepsia e desinfecção do SCR aplicadas durante o tratamento endodôntico prévio foram adequadas, já que a maior parte dos tratamentos não foi realizada pelos autores. No entanto, dentes com uma qualidade de obturação radiograficamente adequada estão geralmente associados a um maior índice de sucesso do que aqueles com obturações inadequadas (FRIEDMAN, 2008). Neste estudo, a qualidade do tratamento também foi inferida com base em TCFC, o que, indiscutivelmente, melhora a análise. Todos os casos foram considerados como insucesso do tratamento ou retratamento, levando em consideração o relato de cada paciente sobre a história pregressa, bem como o aumento ou a permanência do tamanho da lesão quando comparada a exames anteriores. Todos os dentes apresentavam indicação para cirurgia perirradicular considerando que o retratamento já havia sido realizado, ou o retratamento não poderia ser realizado por impossibilidade de acesso à porção apical do SCR ou o retratamento não ofereceria melhores resultados (SIQUEIRA et al., 2014). Bactérias foram detectadas em 21 dos 27 fragmentos apicais analisados. Nos casos positivos, a média total de carga bacteriana foi de 5,7×104 células bacterianas. Esta contagem se aproximou bastante da encontrada em um estudo, onde foi realizada coleta com cones de papel absorvente durante o retratamento de dentes com lesão perirradicular (RODRIGUES et al., 2015). É importante fornecer as contagens absolutas para que se possa ter uma ideia do total dos níveis bacterianos no terço apical do SCR de dentes com tratamento endodônticos adequados radiograficamente. No entanto, os dados também foram ajustados para contagens por 100mg de pó gerado pela pulverização, a fim de permitir uma comparação com estudos

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futuros. Isto foi feito porque o comprimento dos espécimes variou, o que pode influenciar a contagem absoluta em cada caso e dificultar comparações. Estudos anteriores, usando coleta convencional com pontas de papel absorvente

apresentaram

contagens

bacterianas

em

dentes

tratados

endodonticamente variando de 103 a 107 células bacterianas (SEDGLEY et al., 2006; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). Um estudo usando qPCR para analisar ápices radiculares de dentes tratados endodonticamente revelou um número médio de 107 células bacterianas (SUBRAMANIAN & MICKEL, 2009). É difícil comparar as contagens bacterianas entre estudos utilizando diferentes métodos e critérios de inclusão, uma vez que estes fatores certamente influenciam os resultados. O presente estudo não encontrou contagens bacterianas superiores a 105 células bacterianas. Porém, esses valores menores quando comparados com outros estudos podem ser explicados pelo fato de somente ápices de dentes com tratamento endodôntico adequado terem sido avaliados. Espera-se que esses dentes mostrem uma contagem bacteriana mais baixa do que nos dentes com tratamento endodôntico inadequado. É importante salientar que a magnitude do número de bactérias observada foi aparentemente suficiente para manter a doença perirradicular. Neste estudo, o grupo bacteriano encontrado em maior prevalência foi o gênero Streptococcus, seguido por membros do filo Actinobacteria e a espécie Pseudoramibacter

alactolyticus.

Estes

resultados

corroboram

estudos

anteriormente realizados, nos quais utilizaram métodos de cultura e métodos moleculares para avaliar a microbiota de todo o canal principal (SUNDQVIST et

32

al., 1998; PINHEIRO et al., 2003; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; CHUGAL et al., 2011; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012; WANG et al., 2012). No presente estudo, foram utilizados primers para identificar o gênero Streptococcus, pois inúmeras pesquisas encontraram representantes deste gênero em dentes com lesão perirradicular pós-tratamento (SUNDQVIST et al., 1998; PINHEIRO et al., 2003; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). Porém, a maioria destes trabalhos não mostra uma espécie específica envolvida com a doença pós-tratamento. Streptococcus spp. corresponderam a mais de 95% do total da população bacteriana nos seis de dezesseis casos nos quais foram encontrados. As altas prevalência e abundância relativa em inúmeros casos sugerem que os Streptococcus são bactérias diretamente relacionadas ao fracasso endodôntico. Actinobacteria é um filo geralmente representado nas infecções endodônticas pelos gêneros Actinomyces e Propionibacterium, os quais têm sido

encontrados

em

inúmeros

estudos

que

avaliaram

infecções

persistentes/secundárias (SUNDQVIST et al., 1998; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; CHUGAL et al., 2011; WANG et al., 2012). Espécies de Actinomyces e Propionibacterium propionicum podem estar relacionadas aos casos de fracasso endodôntico por serem causadoras da actinomicose perirradicular. Nenhum trabalho realizado para analisar actinomicose perirradicular verificou de forma consistente, as condições microbiológicas da porção apical do canal. Por isso, não é possível concluir se esta seria um tipo de infecção extrarradicular dependente ou independente da intrarradicular (RICUCCI & SIQUEIRA, 2008; SIQUEIRA et al., 2015). No presente estudo, foi realizada uma descontaminação da superfície radicular externa, ou seja, estes micro-

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organismos foram encontrados no interior do SCR. Actinomyces têm sido identificados em cerca de 10% dos casos de fracasso (SIQUEIRA et al., 2002), porém alguns estudos têm apresentado prevalências mais elevadas (TANG et al. 2003; XIA & BAUMGARTNER, 2003), podendo variar de 3% a 24% para Actinomyces (MOLANDER et al. 1998; SUNDQVIST et al. 1998; CHEUNG & HO, 2001; HANCOCK et al. 2001; PINHEIRO et al. 2003) e 2% a 8% para Propionibacterium propionicum (SUNDQVIST et al., 1998; PINHEIRO et al. 2003; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2003b). No presente estudo, em quatro dos onze casos nos quais a Actinobacteria foi detectada, estas bactérias correspondiam a mais de 50% do total da população bacteriana. Pseudoramibacter alactolyticus tem sido encontrado com frequência em dentes tratados endodonticamente (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2004; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). É uma espécie bacteriana que muitas vezes é difícil de cultivar. Tal dificuldade pode ter por muito tempo ofuscado a sua importância como um patógeno endodôntico. Nas infecções primárias, esta espécie Grampositiva pode ser encontrada em prevalência tão alta quanto os mais frequentes Gram-negativos (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2003a; SIQUEIRA et al., 2015). Estudos que avaliaram a microbiota associada ao fracasso endodôntico relataram a ocorrência de Pseudoramibacter alactolyticus, porém em prevalência mais baixa, quando comparada à microbiota dos dentes sem tratamento endodôntico (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2003; SIQUEIRA et al., 2015). Usando cultura, SUNDQVIST et al. (1998) encontraram esta espécie em apenas 1 dos 24 (4,2%) casos, enquanto MOLANDER et al. (1998) isolaram P. alactolyticus somente em 1 dos 68 (1,5%) casos. Comumente ocorre em infecções mistas, sendo inteiramente possível que esta espécie bacteriana

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possa atuar, juntamente com outras bactérias, na indução da doença perirradicular (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2003a). No presente estudo, esta espécie foi dominante nos quatro casos nos quais foi detectada. Enterococcus faecalis tem sido detectado em infecções intrarradiculares primárias e persistentes. De acordo com os estudos, a frequência de detecção utilizando a método de cultura nas infecções primárias e persistentes varia de 2% a 13% e de 8% a 71%, respectivamente (GOMES et al., 2004; GOMES et al., 2006; SEDGLEY et al., 2006; GUO et al., 2011). No método de PCR, o índice variou de 5% a 82% e de 10% a 76% respectivamente (RÔÇAS et al., 2004; FOSCHI et al., 2005; GOMES et al., 2006; SEDGLEY et al., 2006; PIRANI et al., 2008; OZBEK et al., 2009; DUMANI et al., 2012; GONG & BOU, 2012). Estas diferenças podem ser atribuídas ao tamanho da amostra, à qualidade do tratamento inicial, ao material de obturação e às diferentes técnicas de identificação. Tradicionalmente,

as

bactérias

que

participam

nas

infecções

endodônticas têm sido estudadas usando a técnica de cultura, que se baseia no isolamento, crescimento e identificação laboratorial, de acordo com testes morfológicos e bioquímicos. No entanto, a última década trouxe muitos avanços na identificação microbiológica utilizando métodos moleculares. O uso desses métodos permite identificar de forma rápida e mais precisa várias espécies bacterianas (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2005a). O método molecular PCR em tempo real pode ser quantitativo e também tem sido aplicado para detectar a prevalência do Enterococcus faecalis (SEDGLEY et al., 2006; OZBEK et al., 2009).

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RÔÇAS et al. (2004) afirmaram que o Enterococcus faecalis está mais associado a casos assintomáticos do que a casos sintomáticos. Uma possível explicação para o resultado está no fato dos Enterococcus possuírem baixa virulência (KOCH et al., 2004). Eles conseguem se adaptar ao ambiente do canal radicular alterado pelo tratamento endodôntico, mas a participação na patogênese tem sido questionada (ZOLETTI et al., 2006; ZHANG et al., 2015). A prevalência do Enterococcus faecalis não foi acentuada (14%) quando comparada com estudos anteriores (PORTENIER et al., 2003; ZERELLA et al., 2005; SEDGLEY et al., 2006; GOMES et al., 2008; RÔÇAS et al., 2008; TENNERT et al., 2014). O papel dessa espécie como principal patógeno, relacionado ao fracasso endodôntico tem sido questionado (KAUFMAN et al., 2005; ZOLETTI et al., 2006; RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). Embora os resultados apresentados possam estar relacionados a questões técnicas, tais como os primers utilizados, é importante salientar que métodos moleculares menos sensíveis, usando os mesmos primers, detectaram esta espécie em uma prevalência muito maior (RÔÇAS & SIQUEIRA, 2012). Se o Enterococcus faecalis realmente for um membro de infecções intrarradiculares secundárias, a sua baixa prevalência neste estudo está provavelmente relacionada com a qualidade, considerada adequada radiograficamente, do tratamento dos canais radiculares e das restaurações coronárias dos dentes avaliados. Em casos como estes, os riscos de infecções secundárias são, consideravelmente, reduzidos. Outra razão para a diferença na prevalência do Enterococcus faecalis pode estar no fato de que outros estudos avaliaram as condições bacteriológicas de todo o canal (SEDGLEY et al., 2006; GOMES et al., 2008; RÔÇAS et al., 2008; TENNERT et al., 2014), enquanto este estudo restringiu-

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se ao terço apical do SCR. Mesmo assim, em dois casos nos quais o Enterococcus faecalis foi detectado, esta espécie foi amplamente dominante, correspondendo a mais de 98% do total da população bacteriana. Isto significa que, em alguns casos, o Enterococcus faecalis pode realmente ser o principal agente patogênico associado à doença. Este estudo está em consonância com os resultados das análises moleculares anteriores, realizadas em dentes com tratamento endodôntico, nos quais comunidades bacterianas mistas foram encontradas na maioria das amostras

(SAKAMOTO

et

al.,

2008;

RÔÇAS

&

SIQUEIRA,

2012).

Considerando que foram avaliados apenas sete grupos de bactérias ou espécies, não é possível inferir quantas espécies estavam presentes em cada caso. É importante ressaltar que, somente em 2 dos 21 casos nos quais bactérias foram encontradas, nenhum dos grupos alvo foi dominante no total da população bacteriana. As espécies mais prevalentes na microbiota tem o potencial de serem os principais agentes patogênicos em cada caso, embora a importância das outras espécies, na ecologia dos biofilmes associados à lesão perirradicular não possa ser subestimada. Outros trabalhos devem explorar toda a diversidade bacteriana em amostras pulverizadas do terço apical do SCR de dentes com tratamento endodôntico adequado. Neste estudo foram utilizados 27 ápices coletados durante cirurgias perirradiculares. Em seis ápices, não foram encontradas bactérias no SCR. Estes dentes possuíam tratamentos endodônticos realizados entre dois e oito anos antes do procedimento cirúrgico, sendo que, em dois desses casos, as lesões apresentavam o seu maior diâmetro acima de 5mm e os outros quatro casos apresentavam o maior diâmetro abaixo de 5mm. É possível que algumas

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dessas lesões pudessem ser, na realidade, uma área de cicatrização. No entanto, o fato de terem permanecido do mesmo tamanho ou, até mesmo, aumentado em um período mínimo de dois anos, além de, no exame histopatológico, o resultado da análise ter identificado as lesões como granulomas perirradiculares, indicam o contrário. O fato de bactérias não terem sido identificadas, não caracteriza sua ausência no SCR dos respectivos dentes. Mesmo tendo utilizado um método molecular altamente sensível, as bactérias podem ter passado despercebidas ou estavam localizadas em regiões mais coronárias, permanecendo fora da área de ressecção radicular ou, ainda, além do forame apical, caracterizando uma infecção extrarradicular. Existe a possibilidade, nesta última opção, das bactérias estarem presentes na lesão, não tendo a mesma sido avaliada quanto à presença de bactérias, ou poderiam estar na superfície externa da raiz, que foi desinfetada antes da análise. Na verdade, o protocolo experimental e as técnicas utilizadas neste estudo não permitem especulações sobre as possíveis causas dos fracassos endodônticos nestes seis casos em que indícios de infecção não foram encontrados.

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8. CONCLUSÕES _______________________________________________________________

O presente estudo realizou a análise quantitativa de bactérias totais e de vários patógenos endodônticos na região apical do SCR de dentes com tratamento endodôntico radiograficamente adequado e associados com periodontite apical. Este tipo de análise não só mostra a prevalência, mas também a abundância e é crucial para confirmar a associação de algumas espécies com a etiologia da doença. Deste modo, membros do gênero Streptococcus e do filo Actinobacteria, bem como a espécie Pseudoramibacter alactolyticus foram os mais prevalentes e muitas vezes dominantes nas comunidades bacterianas apicais, indicando que os mesmos podem exercer papel importante na persistência de lesões inflamatórias perirradiculares após tratamento endodôntico aparentemente bem executado. A baixa prevalência de Enterococcus faecalis na porção apical de dentes com lesão pós-tratamento leva ao questionamento quanto ao status desta espécie como o principal patógeno deste tipo de doença.

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9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alves FR, Siqueira JF Jr, Carmo FL, Santos AL, Peixoto RS, Rôças IN, Rosado AS (2009). Bacterial community profiling of cryogenically ground samples from the apical and coronal root segments of teeth with apical periodontitis. J Endod 35: 486-492. Anderson AC, Al-Ahmad A, Elamin F, Jonas D, Mirghani Y, Schilhabel M, Karygianni L, Hellwig E, Rehman A (2013). Comparison of the bacterial composition and structure in symptomatic and asymptomatic endodontic infections associate with root-filled teeth using pyrosequencing. PLoS ONE 8: 113. Arnold M, Ricucci D, Siqueira JF Jr (2013). Infection in a complex network of apical ramifications as the cause of persistente apical periodontitis: a case report. J Endod 39: 1179-1184. Barthel CR, Zimmer S, Trope M (2004). Relationship of radiologic and histologic signs of inflammation in human root-filled teeth. J Endod 30: 75–79. Bassler BL (1999). How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing. Curr Opin Microbiol 2: 582-587. Baumgartner JC, Falkler WA Jr (1991). Bacteria in the apical 5mm of infected root canals. J Endod 17: 380-383. Blome B, Braun A, Sobarzo V, Jepsen S (2008) Molecular identification and quantification of bacteria from endodontic infections using real-time polymerase chain reaction. Oral Microbiol Immunol 23: 384-390. 40

Brynolf L (1967). Histological and roentgenological study of periapical region of human upper incisors. Odontol Revy 18 (Suppl 11): 1-176. Byström A, Claesson R, Sundqvist G (1985). The antibacterial effect of camphorated

paramonochlorophenol,

camphorated

phenol

and

calcium

hydroxide in the treatment of infected root canals. Endod Dent Traumatol 1: 170-175. Byström A, Sundqvist G (1981). Bacteriologic evaluation of the efficacy of mechanical root canal instrumentation in endodontic therapy. Scand J Dent Res 89: 321-328. Carr GB, Schwartz RS, Schaudinn C (2009). Ultrastructural examination of failed molar retreatment with secondary apical periodontitis: an examination of endodontic biofilms in an endodontic retreatment failure. J Endod 35: 13031309. Cheung GS, Ho MW (2001). Microbial flora of root canal-treated teeth associated with asymptomatic periapical radiolucent lesions. Oral Microbiol Immunol 16: 332-337. Chugal N, Wang JK, Wang R, He X, Kang M, Li J, Zhou X, Shi W, Lux R (2011). Molecular characterization of the microbial flora residing at the apical portion of infected root canals of human teeth. J Endod 37: 1359-1364. Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ (2002). Biofilm formation in medicated root canals. J Endod 28: 689-693.

41

Donlan RM, Costerton JM (2002). Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 15: 167-193. Dumani A, Yoldas O, Yilmaz S, Koksal F, Kayar B, Akcimen B, Seydaoglu G (2012). Polymerase chain reaction of Enterococcus faecalis and Candida albicans in apical periodontitis from Turkish patients. J Clin Exp Dent 4: e34–39. Engström B, Hard AF, Segerstad L, Ramström G, Frostell G (1964). Correlation of positive cultures with the prognosis for root canal treatment. Odontol Revy 15: 257-270. Eriksen HM (1991). Endodontology: epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol 7: 189-195. Eriksen HM, Kirkevang L-L, Petersson K (2002). Endodontic epidemiology and treatment outcome: general considerations. Endod Topics 2: 1-9. Estrela C, Holland R, Estrela CRA, Alencar AHG, Sousa-Neto MD, Pécora JD (2014a). Characterization of sucessful root canal treatment. Braz Dent J 25: 311. Estrela C, Silva JA, Decurcio DA, Alencar AHG, Estrela CRA, Faitaroni LA, Batista AC (2014b). Monitoring nonsurgical and surgical root canal treatment of teeth with primary and secondary infections. Braz Dent J 25: 494-501. Fabricius L, Dahlén G, Ohman AE, Möller AJR (1982). Predominant indigenous oral bacteria isolated from infected root canals after varied times of closure. Scand J Dent Res 90: 134-144.

42

Falker WA Jr, Martin SA, Tolba M, Siegel MA, Mackler BF (1987). Reaction of pulpal

immunoglobulins

to

oral

microorganisms

by

an

enzyme-linked

immunosorbent assay. J Endod 13: 260-266. Fidgor D, Sundqvist G (2007). A big role for the very small – understanding the endodontic microbial flora. Aust Dent J 52: (Suppl 1): 38-51. Foschi F, Cavrini F, Montebugnoli L, Stashenko P, Sambri V, Prati C (2005). Detection of bacteria in endodontic samples by polymerase chain reaction assays and association with defined clinical signs in Italian patients. Oral Microbiol Immunol 20: 289–95. Friedman S (2008). Expected outcomes in the prevention and treatment of apical periodontitis. In: Ørstavik D, Pitt Ford T (eds) Essential Endodontology. Oxford, UK: Blackwell Munksgaard Ltd, 408-469. Georgopoulou MK, Spanaki- Voreadi AP, Pantazis N, Kontakiotis EG, Morfis AS (2008). Periapical status and quality of root canal fillings and coronal restorations in a Greek population. Quintessence Int 39: e85- e92. Gomes BP, Pinheiro ET, Gade-Neto CR, Souza EL, Ferraz CC, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-Filho FJ (2004). Microbiological examination of infected dental root canals. Oral Microbiol Immunol 19: 71–76. Gomes BP, Pinheiro ET, Jacinto RC, Zaia AA, Ferraz CC, Souza-Filho FJ (2008). Microbial analysis of canals of root-filled teeth with periapical lesions using polymerase chain reaction. J Endod 34: 537-540.

43

Gomes BP, Pinheiro ET, Sousa EL, Jacinto RC, Zaia AA, Ferraz CC, SouzaFilho FJ (2006). Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and by polymerase chain reaction analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 102: 247–253. Gong M, Bou B (2012). Determination of root canal microorganisms isolated from teeth with chronic apical periodontitis. Beijing J Stomatol 20: 310–313. Green TL, Walton RE, Taylor JK, Merrell P (1997). Radiographic and histologic periapical findings of root canal treated teeth in cadaver. Oral Surg Oral Med Oral Patholol Oral Radiol Endod 83: 707–711. Guo H, Tian Q, Gao C (2011). Microbiological status of untreated and root-filled teeth associated with chronic apical periodontitis. J Pract Stomatol 27: 71–74. Hall-Stoodley L, Stoodley P (2009). Evolving concepts in biofilm infections. Cell Microbiol 11: 1034–1043. Hancock HH 3rd, Sigurdsson A, Trope M, Moiseiwitsch J (2001). Bacteria isolated after unsuccessful endodontic treatment in a north American population. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 91: 579-586. Hong BY, Lee TK, Lim SM, Chang SW, Park J, Han SH, Zhu Q, Safavi KE, Fouad AF, Kum KY (2013). Microbial analysis in primary and persistent endodontic infections by using pyrosequencing. J Endod 39: 1136-1140. Jang JH, Lee JM, Yi JK, Choi SB, Park SH (2015). Surgical endodontic management of infected lateral canals of maxillary incisors. Restor Dent Endod 40: 79-84.

44

Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ (1965). The effects of surgical exposures of dental pulps in germ-free and convencional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 18: 340-348. Karygianni L, Anderson AC, Tennert C, Kollmar K, Altenburger MJ, Hellwig E, Al-Ahmad A (2015). Supplementary sampling of obturation materials enhances microbial analyses of endodontic treatment failures: a proof of principle study. Clin Oral Invest 19: 319-327. Kaufman B, Spångberg L, Barry J, Fouad AF (2005). Enterococcus spp. in endodontically treated teeth with and without periradicular lesions. J Endod 31: 851-856. Kishen A (2010). Advanced therapeutic options for endodontic biofilms. Endod Topics 22: 99-123. Koch S, Hufnagel M, Theilacker C, Huebner J (2004). Enterococcal infections: host response, therapeutic, and prophylactic possibilities. Vaccine 22: 822–830. Kontogiannis TG, Tosios KI, Kerezoudis NP, Krithinakis S, Christopoulos P, Sklavounou A (2015). Periapical lesions are not always a sequelae of pulpal necrosis: a retrospective study of 1521 biopsies. Int Endod J 48: 68-73. Koppang HS, Koppang R, Solhein T, Aarnes H, Stolen SO (1989). Cellulose fibers from endodontic paper points as an etiological factor in postendodontic periapical granulomas and cysts. J Endod 15: 369-372. Lin LM, Skribner JE, Gaengler P (1992). Factor associated with endodontic treatment failures. J Endod 18: 625-627.

45

Miller MB, Bassler BL (2001). Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 55: 165-199. Miller WD (1864). An introduction to the study of the bacterial-pathology of the dental pulp. Dent Cosmos 36: 505-528. Molander A, Reit C, Dahlen G, Kvist T (1998). Microbiological status of rootfilled teeth with apical periodontitis. Int Endod J 31: 1-7. Möller AJR, Fabricius L, Dahlén G, Ohman AE, Geyden G (1981). Influence on periapical tissues of indigenous oral bacteria and necrotic pulp: tissue in monkeys. Scand J Dent Res 89: 475-484. Munson MA, Pitt-Ford T, Chong B, Weightman A, Wade WG (2002). Molecular and cultural analysis of the microflora associated with endodontic infections. J Dent Res 81: 761-766. Murad CF, Sassone LM, Faveri M, Hirata R, Jr, Figueiredo L, Feres M (2014). Microbial diversity in persistent root canal infections investigated by checkerboard DNA-DNA hybridization. J Endod 40: 899-906. Nair PNR (1999). Cholesterol as an aetiological agent in endodontic failures – a review. Aust Endod J 25: 19-26. Nair PNR (2006). On the causes of persistent apical periodontitis: a review. Int Endod J 39: 249-281. Nair PN, Henry S, Cano V, Vera J (2005). Microbial status of apical root canal system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after

46

“one-visit” endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 99: 231-252. Ozbek S, Ozbek A, Erdogan A (2009). Analysis of Enterococcus faecalis in samples from Turkish patients with primary endodontic infections and failed endodontic treatment by real-time PCR SYBR green method. J Appl Oral Sci 17: 370–374. Özok AR, Persoon IF, Huse SM, Keyser BJ, Wesselink PR, Crielaard W, Zaura E (2012). Ecology of the microbiome of the infected root canal system: a comparison between apical and coronal root segments. Int Endod J 45: 530– 541. Parsek MR, Greenberg EP (2005). Sociomicrobiology: the connections between quorum sensing and biofilms. Trends Microbiol 13: 27-33. Parsek MR, Singh PK (2003). Bacterial biofilms: an emerging link to disease pathogenesis. Annu Rev Microbiol 57: 677–701. Pinheiro ET, Gomes BP, Ferraz CC, Sousa EL, Teixeira FB, Souza-Filho FJ (2003). Microorganisms from canals of root-filled teeth with periapical lesions. Int Endod J 36: 1-11. Pirani C, Bertacci A, Cavrini F, Foschi F, Acquaviva GL, Prati C, Sambri V (2008). Recovery of Enterococcus faecalis in root canal lumen of patients with primary and secondary endodontic lesions. New Microbiol 31: 235–240. Portenier I, Waltimo TMT, Haapasalo M (2003). Enterococcus faecalis - the root canal survivor and 'star' in post-treatment disease. Endod Topics 6: 135-159.

47

Ray HA, Trope M (1995). Periapical status of endodontically treated teeth in relation to the technical quality of the root filling and the coronal restoration. Int Endod J 28: 12-18. Reeves R, Stanley HR (1966). The relationship of bacterial penetration and pulpal pathosis in carious teeth. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 22: 59-65. Ricucci D, Loghin S, Siqueira JF Jr (2013). Exuberant biofilm infection in a lateral canal as the cause of short-term endodontic treatment failure: report of a case. J Endod 39: 712-718. Ricucci D, Siqueira JF Jr. (2008). Apical actinomycosis as a continuum of intraradicular and extraradicular infection: case report and critical review on its involvement with treatment failure. J Endod 34: 1124-1129. Ricucci D, Siqueira JF Jr (2010). Biofilms and apical periodontitis: study of prevalence and association with clinical and histopathologic findings. J Endod 36: 1277–1288. Ricucci D, Siqueira JF Jr (2011). Recurrent apical periodontitis and late endodontic treatment failure related to coronal leakage: a case report. J Endod 37: 1171-1175. Ricucci D, Siqueira JF Jr, Bate AL, Pitt Ford TR (2009). Histologic investigation of root canal-treated teeth with apical periodontitis: a retrospective study from twenty-four patients. J Endod 35: 493-502.

48

Ricucci D, Siqueira JF Jr, Lopes WSP, Vieira AR, Rôças IN (2015). Extraradicular infection as the cause of persistent symptoms: a case series. J Endod 41: 265-273. Rodrigues RCV, Antunes HS, Neves MAS, Siqueira JF Jr, Rôças IN (2015). Infection control in retreatment cases: in vivo antibacterial effects of 2 instrumentation systems. J Endod 41: 1600-1605. Rolph HJ, Lennon A, Riggio MP, Saunders WP, Mackenzie D, Coldero L, Bagg J (2001). Molecular identification of microorganisms from endodontic infections. J Clin Microbiol 39: 3282-3289. Rôças IN, Alves FRF, Santos AL, Rosado AS, Siqueira JF Jr (2010). Apical root canal microbiota as determined by reverse-capture checkerboard analysis of cryogenically ground root samples from teeth with apical periodontitis. J Endod 36: 1617-1621. Rôças IN, Hülsmann M, Siqueira JF Jr. (2008). Microorganisms in root canaltreated teeth from a German population. J Endod 34: 926-931. Rôças IN, Siqueira JF Jr (2010). Identification of bacteria enduring endodontic treatment procedures by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction and reverse-capture checkerboard approach. J Endod 36: 45-51. Rôças IN, Siqueira JF Jr (2011). In vivo antimicrobial effects of endodontic treatment procedures as assessed by molecular microbiologic techniques. J Endod 37: 304-310.

49

Rôças IN, Siqueira JF Jr (2012). Characterization of microbiota of root canaltreated teeth with post-treatment disease. J Clin Microbiol 50: 1721-1724. Rôças IN, Siqueira JF Jr, Santos KR (2004). Association of Enterococcus faecalis with different forms of periradicular diseases. J Endod 30: 315-320. Rosa TP, Signoretti FGC, Montagner F, Gomes BPFA, Jacinto RC (2015). Prevalence of Treponema spp. in endodontic retreatment-resistent periapical lesions. Braz Oral Res 29: 1-7. Sakamoto M, Siqueira JF Jr, Rôças IN, Benno Y (2006). Molecular analysis of bacteria in asynptomatic and synptomatic endodontic infections. Oral Microbiol Immunol 21: 112-122. Sakamoto M, Siqueira JF Jr, Rôças IN, Benno Y (2008). Molecular analysis of the root canal microbiota associated with endodontic treatment failures. Oral Microbiol Immunol 23: 275–281. Sedgley C, Nagel A, Dahlen G, Reit C, Molander A (2006). Real-time quantitative polymerase chain reaction and culture analyses of Enterococcus faecalis in root canals. J Endod 32: 173-177. Siqueira JF Jr (2002). Endodontic infections: concepts, paradigms, and perspectives. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 94: 281-293. Siqueira, JF Jr (2008). Microbiology of apical periodontitis. In: Ørstavik D, Pitt Ford T (eds). Essential Endodontology. Oxford, UK: Blackwell Munksgaard Ltd, 135-196.

50

Siqueira JF Jr (2011). Treatment of endodontic infections. 1ª ed. Berlin, Germany: Quintessence Publishing, 403 p. Siqueira JF Jr, Alves FR, Rôças IN (2011). Pyrosequencing analysis of the apical root canal microbiota. J Endod 37: 1499–1503. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2003a). Pseudoramibacter alactolyticus in primary endodontic infections. J Endod 29: 735–738. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2003b). Polymerase chain reaction detection of Propionibacterium propionicus and Actinomyces radicidentis in primary and secondary endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 96: 215-222. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2004). Polymerase chain reaction-based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 97: 85-94. Siqueira JF Jr, Rocas IN (2005a). Exploiting molecular methods to explore endodontic infections: Part 1. Current molecular technologies for microbiological diagnosis. J Endod 31: 411–423. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2005b). Exploiting molecular methods to explore endodontic infections. Part 2. Redefining the endodontic microbiota. J Endod 31: 488-498. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2007). Bacterial pathogenesis and mediators in apical periodontitis. Braz Dent J 18: 267-280.

51

Siqueira JF Jr, Rôças IN (2008). Clinical implications and microbiology of bacterial persistence after treatment procedures. J Endod 34: 1291-1301. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2009a). Community as the unit of pathogenicity: an emerging concept as to the microbial pathogenesis of apical periodontitis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 107: 870-878. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2009b). Diversity of endodontic microbiota revisited. J Dent Res 88: 969-981. Siqueira JF Jr, Rôças IN (2009c). Distinctive features of the microbiota associated with different forms of apical periodontitis. J Oral Microbiol 1: DOI: 10.3402/jom.v1i0.2009. Siqueira JF Jr, Rôças IN, Alves FR, Santos KR (2004). Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals: a molecular investigation. J Endod 30: 638-643. Siqueira JF Jr, Rôças IN, Alves FR, Silva MG (2009). Bacteria in the apical root canal of teeth with primary apical periodontitis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 107: 721-726. Siqueira JF Jr, Rôças IN, Lopes HP (2015). Microbiologia endodôntica. In: Lopes HP, Siqueira JF Jr (eds). Endodontia: biologia e técnica. Rio de Janeiro, RJ: Elsevier, 63-91. Siqueira JF Jr, Rôças IN, Paiva SS, Magalhães KM, Guimarães-Pinto T (2007). Cultivable bacteria in infected root canals as identified by 16S rRNA gene sequencing. Oral Microbiol Immunol 22: 266–271.

52

Siqueira JF Jr, Rôças IN, Ricucci D, Hulsmann M (2014). Causes and management of post-treatment apical periodontitis. Br Dent J 216: 305-312. Siqueira JF Jr, Rôças IN, Souto R, de Uzeda M, Colombo AP (2002). Actinomyces species, streptococci, and Enterococcus faecalis in primary root canal infections. J Endod; 28: 168-172. Sjögren U, Figdor D, Persson S, Sundqvist G (1997). Influence of infection at the time of root filling on the outcome of endodontic treatment of teeth with apical periodontitis. Int Endod J 30: 297-306. Smith T (1934). Parasitism and disease. 1ª ed. Princeton, NJ: Princeton University Press, 222 p. Subramanian

K,

Mickel

AK

(2009).

Molecular

analysis

of

persistent

perirradicular lesions and root ends reveals a diverse microbial profile. J Endod 35: 950-957. Sundqvist G (1976). Bacteriological studies of necrotic dental pulps. Dissertation. University of Umea, Umea, Sweden, 94p. Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjogren U (1998). Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative retreatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 85: 86-93. Tang G, Samaranayake LP, Yip HK, Chu FC, Tsang PC (2003). Direct detection of Actinomyces spp. from infected root canals in a Chinese population: a study using PCRbased, oligonucleotide-DNA hybridization technique. J Dent 31: 559-568.

53

Tang G, Samaranayake LP, Yip HK (2004). Molecular evaluation of residual endodontic microorganisms after instrumentation, irrigation and medication with either calcium hydroxide or septomixine. Oral Dis 10: 389-397. Tennert C, Fuhrmann M, Wittmer A, Karygianni L, Altenburger MJ, Pelz K, Hellwig E, Al-Ahmad A (2014). New bacterial composition in primary and persistent/secondary endodontic infections with respect to clinical and radiographic findings. J Endod 40: 670-677. Tran KT, Torabinejad M, Shabahang S, Retamozo B, Aprecio RM, Chen JW (2013). Comparison of efficacy of pulverization and sterile paper point techniques for sampling root canals. J Endod 39: 1057-1059. Trowbridge HO (2009). Histologia da Inflamação pulpar. In: Hargreaves KM, Goodis HE (eds). Polpa Dentária de Seltzer e Bender. São Paulo, SP: Quintessence Editora, 227-245. Tzanetakis GN, Azcarate-Peril A, Zachaki S, Panapoulos P, Kontakiotis EG, Madianos PN, Divaris K (2015). Comparision of bacterial community composition

of

primary

and

persistente

endodontic

infections

using

pyrosequencing. J Endod 41: 1226-1233. Vera J, Siqueira JF Jr, Ricucci D, Loghin S, Fernandez N, Flores B, Cruz AG (2012). One versus two-visit endodontic treatment of teeth with apical periodontitis: a histobacteriologic study. J Endod 38: 1040–1052. Vieira AR, Siqueira JF Jr, Ricucci D, Lopes WSP (2012). Dentinal tubule infection as the cause of recurrent disease and late endodontic treatment failure: A case report. J Endod 38: 250–254. 54

Waltimo TM, Siren EK, Orstavik D, Haapasalo MP (1999). Susceptibility of oral Candida species to calcium hydroxide in vitro. Int Endod J 32: 94-98. Wang J, Jiang Y, Chen W, Zhu C, Liang J (2012). Bacterial flora and extraradicular biofilm associated with the apical segment of teeth with posttreatment apical periodontitis. J Endod 38: 954-959. Warfvinge J, Bergenholtz G (1986). Healing capacity of human and monkey dental pulps following experimentally induced pulpitis. Endod Dent Traumatol 2: 256-262. Weigner R, Axmann-Kremar K, Löst C (1998). Prognosis of conventional root canal treatment considered. Endod Dent Traumatol 14: 1-9. Williams JM, Trope M, Caplan DJ, Shugars DC (2006). Detection and quantitation of E. faecalis by real-time PCR (qPCR), reverse transcription-PCR (RT-PCR), and cultivation during endodontic treatment. J Endod 32: 715-721. Wu MK, Dummer PMH, Wesselink PR (2006). Consequences of and strategies to deal with residual post-treatment root-canal infection. Int Endod J 39: 343356. Xia T, Baumgartner JC (2003). Occurrence of Actinomyces in infections of endodontic origin. J Endod 29: 549-552. Zehnder M, Belibasakis GN (2015). On the dynamics of root canal infections – what we understand and what we don’t. Virulence 3: 216-222. Zerella JA, Fouad AF, Spangberg LSW (2005). Effectiveness of a calcium hydroxide and chlorhexidine digluconate mixture as disinfectant during 55

retreatment of failed endodontic cases. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 100: 756-761. Zhang C, Du J, Peng Z (2015). Correlation between Enterococcus faecalis and persistent intraradicular infection compared with primary intraradicular infection: A systematic review. J Endod 41: 1207-1213. Zoletti GO, Siqueira JF Jr, Santos KR (2006). Identification of Enterococcus faecalis in root-filled teeth with or without periradicular lesions by culturedependent and independent approaches. J Endod 32: 722-726.

56

10. ANEXOS

57

10.1. Anexo A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO

TERMO

DE

INFORMAÇÃO,

CONSENTIMENTO

LIVRE

PARA PARTICIPAÇÃO

EM

E

ESCLARECIDO PESQUISA,

PÓS-

CONFORME

RESOLUÇÃO NÚMERO 196 DE 10/10/96, DO CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE. Título

da

pesquisa:

Avaliação

histopatológica,

microbiológica

e

imunológica de lesões perirradiculares e de ápices radiculares removidos durante cirurgia perirradicular Pesquisador responsável: Henrique dos Santos Antunes – Cirurgião-dentista graduado pela Universidade do Grande Rio “PROF. JOSÉ DE SOUZA HERDY (UNIGRANRIO), especialista em Endodontia pela faculdade de UNIGRANRIO, Mestre em Odontologia pela Universidade de Taubaté (UNITAU) e doutorando em Odontologia pela Universidade Estácio de Sá (UNESA). Introdução: Antes de consentir com a sua participação nesta pesquisa, é importante e necessário que você leia atentamente as informações contidas neste documento. Aqui estão os esclarecimentos sobre os objetivos, os benefícios, os riscos, os desconfortos e os procedimentos deste estudo. Esclarece-se também o seu direito de interromper a sua participação no estudo a qualquer momento. Resumo:. A periodontite apical é uma doença inflamatória, de origem microbiana, causada principalmente por uma infecção dos sistemas de canais radiculares, desprovidos de defesa do hospedeiro. Para este estudo, serão selecionados pacientes com lesões perirradiculares causadas por fracassos endodônticos. Durante a cirurgia perirradicular, as lesões serão removidas e armazenadas em frascos com formol 10% tamponado, para serem submetidas à análise histológica e imunológica. Este estudo foi desenhado para avaliar os micro-organismos causadores da doença relacionada as infecções no sistema de canais radiculares, assim como

58

a prevalência de cistos e granulomas e realizar uma avaliação imunológica das lesões perirradiculares. Objetivos: O objetivo deste trabalho será realizar uma contagem total de bactérias, assim como a presença, níveis e abundância relativa de diversos patógenos endodônticos no interior de canais nos fragmentos apicais retirados durante cirurgia perirradicular de dentes com fracasso endodôntico e lesão perirradicular detectadas em tomografias computadorizadas por feixe cônico, utilizando a pulverização criogênica desses fragmentos e a identificação dos micro-organismos com o método molecular PCR-real time. Realizar

uma

análise

imunológica

e

histopatológica

dessas

lesões

perirradiculares. Procedimentos: Selecionamos pessoas que tenham dentes com canais tratados e que apresentem lesão perirradicular que necessitam de cirurgia dos tecidos perirradiculares. As coletas são realizadas durante as cirurgias. Vale lembrar que o conteúdo coletado já seria enviado para exame histopatológico, não havendo nenhum passo diferente na forma do tratamento. Desconforto: Poderá haver ligeiro desconforto transitório, como ocorre após qualquer outra intervenção odontológica de rotina. Riscos: Não haverá risco adicional para você. Benefícios: Possui o benefício de o paciente receber o laudo histopatológico de sua lesão sem custo financeiro adicional. Pagamento: Você não terá nenhum tipo de despesa extra ao autorizar sua participação nesta pesquisa, bem como não receberá qualquer remuneração por esta participação. Confidencialidade: As informações fornecidas sobre você serão acessíveis apenas aos pesquisadores. Dentro dos limites da lei, os dados serão mantidos em sigilo. Contato com o pesquisador: Poderá ser feito com Henrique dos Santos Antunes, telefone 24-99213-9067. Em caso de dúvida quanto aos seus direitos como participante da pesquisa, você deverá ligar para o Comitê de Ética em Pesquisa da UNESA, através do número 21- 3231-6135.

59

Consentimento: Li e entendi as informações contidas neste documento. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas as minhas dúvidas foram respondidas satisfatoriamente. Estou participando desta pesquisa por minha vontade, até que eu decida o contrário.

Eu _______________________________ RG _______________, após a leitura e compreensão destas informações, entendo que minha participação é voluntária, e que posso sair a qualquer momento do estudo sem prejuízo algum. Confirmo que recebi uma cópia deste termo de consentimento e autorizo a execução do trabalho de pesquisa e a divulgação dos dados obtidos neste estudo.

Rio de janeiro,

de

de

60

.

10.2. ANEXO B – Artigos publicados (ou aceitos para publicação)

61

Artigo 02 Ajuz NC, Antunes H, Mendonça TA, Pires FR, Siqueira JF Jr., Armada L (2014). Immunoexpression of Interleukin 17 in Apical Periodontitis Lesions. J Endod 40: 1400-1403.

62

63

64

65

66

Artigo 03 Rodrigues RCV, Antunes HS, Neves MAS, Siqueira JF Jr., Rôças IN (2015). Infection Control in Retreatment Cases: In Vivo Antibacterial Effects of 2 Instrumentation Systems. J Endod 41: 1600-1605.

67

68

69

70

71

72

73

Artigo 4 Antunes HS, Gominho LF, Andrade-Junior CV, Dessaune-Neto N, Alves FRF, Rôças IN, Siqueira JF Jr (2015). Sealing ability of two root-end filling materials in a bacterial nutrient leakage model. Int End J doi:10.1111/iej.12543

74

75

76

77

78

79

80