Toxicidade de extratos de Piper nigrum, piperina e piperamidas para o diplópodo Orthoporus fuscipes em condições de laboratório

REVISTA BRASILEIRA DE TOXICOLOGIA BRAZILIAN JOURNAL OF TOXICOLOGY

Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 33 - 38

Toxicidade de extratos de Piper nigrum, piperina e piperamidas para o diplópodo Orthoporus fuscipes em condições de laboratório Júlia Andrade Romão1, Lilian Boccardo1*, Vanderlúcia Fonseca de Paula2, Ricardo Jucá Chagas1, Bruno Oliveira Moreira2 1

Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Departamento de Ciências Biológicas, Jequié, BA, Brasil; 2 Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia Departamento de Química e Exatas, Jequié, BA, Brasil.

Abstract Toxicity of extracts from Piper nigrum, piperine and piperamides to the millipede Orthoporus fuscipes under laboratory conditions The toxicity of an ethanolic extract of black pepper (Piper nigrum), of piperine and of the synthetic amides adamantylpiperamide, isopentylpiperamide and diisopropylpiperamide was evaluated using the millipede Orthoporus fuscipes. For the experiments, the test organism was exposed to a diet of wheat bran and sugar (9:1) supplemented with the test substance in solution and mortality was monitored over a period of 17 days. Mortality was 100% for 0.3 g of the ethanolic extract of black pepper fruits and for diisopropylpiperamide after 4 and 14 days of exposure, respectively. Piperine at a concentration of 0.3 g resulted in 70% mortality after 4 days and remained at this rate until the end of the exposure period. Thus, among the compounds tested the ethanolic extract of black pepper fruit was the most effective and most promising for the control of Orthoporus fuscipes populations since it promoted a higher rate of mortality of the test organism within a shorter period of exposure. Keywords: millipede, population control, black pepper

INTRODUÇÃO Os Diplópoda compreendem cerca de 11000 espécies descritas. Seus representantes são distribuídos em todo o mundo e habitam preferencialmente os trópicos (1). São conhecidos, popularmente, como piolhos-decobra, caramujis, bichos-do-ouvido, gongos, gongôlos, emboás, milipés e várias outras denominações atribuídas em outras regiões do mundo (2). São encontrados em áreas naturais, jardins, hortas e quintais onde o acúmulo de folhas, detritos, cascas e troncos de árvores conservam umidade e temperatura criando microambientes ideais para sua sobrevivência (3). Desempenham importante papel na dinâmica dos ecossistemas terrestres, principalmente no que se refere à Autor correspondente. Endereço para correspondência: Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Departamento de Ciências Biológicas, Av. José Moreira Sobrinho, s/n°, 45206-190, Jequié, BA, Brasil. Fone: +55 (73) 3528-9656. Fax: +55 (73) 35256683. E-mail: [email protected]

*

© 2008 Sociedade Brasileira de Toxicologia direitos reservados

decomposição, provocando impactos tanto sob o ponto de vista químico quanto mecânico (4-6). Entretanto, em condições de secas prolongadas, escassez de alimento e ocupação de nichos vagos, esses animais podem causar transtornos às populações humanas, tanto rurais quanto urbanas, ao invadirem residências e ao acumularem-se em jardins, hortas, lavouras e quintais (7). Fenômenos desta natureza, no Brasil, foram relatados por Boccardo et al. (8) e Boccardo et al. (9) que registraram a ocorrência e a expansão populacional do diplópodo Plusioporus setiger (Broelemann, 1901) (Diplopoda: Spirostreptidae) em lavouras cafeeiras na região do Alto Paranaíba, MG. Com o intuito de controlar o surto os agricultores utilizaram agrotóxicos organofosforados, carbamatos e piretróides, mas não obtiveram sucesso. Experimentos de laboratório realizados por Boccardo e Fernandes (6) demonstraram, para Gymnostreptus olivaceus Schubart 1944 (Diplopoda: Spirostreptidae) e Plusioporus setiger uma baixa toxicidade do carbamato methiocarb, por aplicação tópica. Boccardo et al. (7), utilizando o piretróide Deltamethrin, com os mesmos diplópodos verificaram, também, uma baixa toxicidade deste para as duas espécies quando aplicados topicamente. Os autores atribuíram a baixa atividade do produto à aplicação tópica, pois diplópodos, principalmente

34

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)

na fase adulta, tem um exoesqueleto calcificado rígido que interfere na penetração do produto. Assim, no caso deste grupo de animais, fazse necessária à adoção de outras formas de aplicação e utilização de defensivos eficientes, menos impactantes, e principalmente em dosagens que acarretem um menor risco ambiental e à saúde humana. Esta é uma preocupação que atinge, de maneira geral, o controle químico de “pragas” de plantas cultivadas, pois é praticamente impossível prever com precisão, o real impacto que os produtos químicos poderão causar, a longo prazo, no meio ambiente (10). Em conseqüência, nos últimos anos, têm aumentado as pesquisas em busca de alternativas para o controle de “pragas” com produtos que possam substituir os agrotóxicos tradicionais, por outros naturais, biodegradáveis e de menor impacto ambiental. Neste contexto, os efeitos biológicos de plantas da família Piperaceae, têm sido estudados (11-15) e as propriedades inseticidas de plantas dessa família, entre elas Piper nigrum L. (Piperaceae), conhecida como pimenta-doreino, são bem conhecidas para muitos organismos exceto para diplópodos. Para outros artrópodos a toxicidade de extratos de frutos da pimenta-do-reino é conhecida desde 1924 (16). Estes extratos são considerados tóxicos para a mosca doméstica Musca domestica Linnaeus, 1758 (Diptera, Muscidae), mosquito Culex pipiens pallens Coquillett, 1898 (Diptera, Culicidae), gorgulho do feijão de corda Callosobruchus chinensis Linnaeus, 1758 (Coleoptera, Bruchidae) (17), bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis Boheman, 1843 (Coleoptera, Curculionidae), caruncho do arroz Sitophilus oryzae (Linnaeus, 1763) (Coleoptera, Curculionidae), caruncho do feijão Acanthoscelides obtectus Say, 1831 (Coleoptera, Bruchidae) (16,18); gorgulho do caupi Callosobruchus maculatus Fabricius, 1775 (Coleoptera, Bruchidae) (19), ao caruncho do feijão Zabrotes subfasciatus Boheman, 1833 (Coleoptera, Bruchidae) (20), e à traça dos cereais Sitotroga cerealella (Oliver, 1819) (Lepidoptera, Gelechiidae) (21); são, ainda, repelentes para adultos da lagarta da espiga do milho Helicoverpa zea (Boddie, 1850) (Lepidoptera, Noctuidae) (16,18). A toxicidade do extrato de frutos da pimenta-doreino para organismos tem sido atribuída à presença de amidas, entre elas a piperina, seu principal constitutinte (22). Em relação à toxicidade da piperina, esta foi reportada para Ascia monuste orseis (Godart, 1818) (Lepidoptera: Peiridae) (23), Ostrinia nubilalis Hubner (24) e larvas de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) resistentes a piretróides (25). Além da piperina, várias outras amidas naturais, com propriedades inseticidas, têm sido isoladas de frutos de Piper nigrum (26), entre elas, várias isobutilamidas. Entretanto, devido à alta concentração da piperina (3-7%) no fruto (27) e, conseqüentemente, maior facilidade de isolamento, neste trabalho optou-se por utilizá-la como

padrão para comparação das atividades apresentadas pelo extrato e pelas piperamidas sintéticas. Apesar do desenvolvimento de várias amidas sintéticas, algumas delas, derivadas das próprias amidas naturais (23), pouco se conhece sobre a atividade biológica destas substâncias, e apenas ensaios para avaliação de suas atividades inseticidas têm sido realizados. Nesta perspectiva este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade do extrato bruto da pimenta-do-reino, da piperina e das piperamidas, por ingestão, no controle do diplópodo sinantrópico Orthoporus fuscipes (PORAT, 1888) (Diplopoda: Spirostreptidae), encontrado na região de Jequié, BA. O estudo visa gerar alternativa de controle viável economicamente que possa ser aplicada em áreas rurais e urbanas infestadas com diplópodos com baixos riscos ambientais e para a saúde humana.

MATERIAL E MÉTODOS Organismos-teste Os exemplares adultos de Orthoporus fuscipes (massa corpórea: 4,0±1,5 g) utilizados neste estudo, foram coletados no Campus Universitário da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB em Jequié, BA. No Laboratório de Zoologia de Invertebrados, os diplópodos foram mantidos em terrários, contendo solo umedecido e material orgânico proveniente dos locais de coleta e alimentados regularmente com folhas de alface e cenoura. Substâncias-teste A obtenção dos extratos brutos de frutos da pimenta-do-reino, bem como o isolamento da piperina, foram realizados no Laboratório de Produtos Naturais da UESB, Campus de Jequié e a síntese das piperamidas foi realizada no Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos da Universidade Federal de Viçosa. Foram utilizados solventes e reagentes da marca Vetec (grau P.A.), exceto o cloreto de oxalila que foi obtido da Aldrich, com grau de pureza de 98%. Os extratos de frutos da pimenta-do-reino foram obtidos por extração com hexano e com etanol 95%, em aparelho tipo Soxhlet (27). O extrato etanólico foi submetido a fracionamento em coluna de sílica gel, utilizando-se como eluente uma mistura de hexano/acetato de etila (2:1), para isolamento da piperina. Três amidas, isopentilpiperamida, adamantilpiperamida e diisopropilpiperamida foram obtidas a partir do ácido pipérico proveniente da hidrólise da piperina, de acordo com os procedimentos descritos nas seguintes etapas. As fórmulas estruturais da piperina e das piperamidas são apresentadas na Figura 1. Etapa 1. Conversão do ácido pipérico em seu respectivo cloreto de ácido: em um balão de fundo redondo (50 mL) dissolveu-se o ácido pipérico (500 mg, 2,29 mmol) em tetraidrofurano (THF) seco (10 mL) e, em seguida, foi adicionado o cloreto de oxalila (C2Cl2O2) (1 mL, 11,5 mmol). Ao balão foi adaptado um tubo contendo cloreto de

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)

41 41

O O

E DISCUSSãO Boccardo L./Revista OBrasileira de RESULTADOS Toxicologia 21, n.1 (2008) RESULTADOS E DISCUSSãO

35

O

R O O N N R O O N N R' O O cálcio (CaCl2) e a solução foi mantida sob agitação durante R' O O (2) R = isopentil; R' = H (1) 6 h, à temperatura ambiente. Após este tempo, oR'solvente (2) (3)R R==isopentil; adamantil; R'= =HH (1) Boccardo (3) ==adamantil; R' =Brasileira H (4)RRL./Revista R'= isopropil e41o excesso de cloreto de oxalila foram completamente (4) R = R'= isopropil

R

R

dade (%) alidade (%)

Mortalidade (%)

Mortalidade (%) Mortalidade (%)

Mortalidade (%)

Mortalidade (%) Mortalidade (%)

Os resultados dos experimentos para a determinação Os resultados dosde experimentos para a determinação da toxicidade do extrato frutos da pimenta-do-reino e da P.A. 95% e ado piperina edeasfrutos piperamidas em clorofórmio da toxicidade extrato da pimenta-do-reino e da piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g),fuscipes bem como P.A. A toxicidade destes solventes para o O. foi em 21, diferentes doses (0,1; 0,2 eestão 0,3 g), bem como de piperina, Toxicologia n.1 (2008) das piperamidas (0,3 g), por ingestão, apresentados avaliada com o mesmo volume utilizado para se efetuar as O O das por ingestão, estão apresentados nas piperamidas Figuras 2O (0,3 a 4.g),Entretanto, diferentes níveis de O removidos sob pressão reduzida em evaporador rotatório, diluições. nas Figuras 2 a 4. Entretanto, diferentes níveis de O O susceptibilidade dos à piperina e às N diplópodos ao extrato, N levando à obtenção de um resíduo. O O susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às N Figura 1: Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas N piperamidas foram observados. RESULTADOS E DISCUSSãO R' Figura 1: Fórmulas piperina (1) e das amidas Oestruturais da(2), O O piperamidas foram observados. sintéticas: isopentilpiperamida adamantilpiperamida Comparando aDISCUSSÃO toxicidade doOextrato e da piperina, R' RESULTADOS E O sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida O R Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, (3) O e isopropilpiperamida (4) O R o= primeiro isopentil; R' = H (1) de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se(2) na dose que N N (3) e isopropilpiperamida (4) Os 0,3 resultados dos experimentos para(2) a(3) determinação R ==primeiro isopentil; (1) de na dose g (Figuras 2 e 3), observa-se que o R adamantil;R'R'= =HH foitoxicidade mais tóxico, pois, após 4 diasdade exposição verificouR' O (3) R adamantil; da do extrato deexperimentos frutos pimenta-do-reino da R' = H Etapa 2 - Obtenção dasO piperamidas: o resíduo (4) R == R'= eisopropil foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificouOs resultados dos para a determinação se 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às Etapa 2 Obtenção das piperamidas: o resíduo (2) R = isopentil; R' = H (4) R = R'= isopropil (1) piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 e 0,3 g), bem como obtido na etapa 1 foi dissolvido em THF seco (4 mL) se 100 esintéticas, 70% de extrato mortalidade, respectivamente. Quanto às da toxicidade do de frutos da pimenta-do-reino e da (3)THF R = adamantil; R'(4 = HmL) amidas cuja dose de exposição foi 0,3 g (Figura obtido na etapa 1 foi dissolvido em seco piperamidas pordeingestão, apresentados Figura 1 das e, a esta solução, foram adicionados(4) cerca de 5 mmol R = R'= isopropil amidas sintéticas, cujaag), dose exposição foig), 0,3 g (Figura piperina, em diferentes doses (0,1; 0,2 eestão 0,3 bem como O (0,3 O 4), aFiguras mais tóxica foi diisopropilpiperamida, seguida pela Figura 1 e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5 mmol nas 2 a(0,3 4.a g), Entretanto, diferentes níveis pela de (aproximadamente dois equivalentes) de cada amina 4), a mais tóxica foi diisopropilpiperamida, seguida das piperamidas por ingestão, estão apresentados isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto (aproximadamente dois equivalentes) de amina O Figura 1. Fórmulas estruturais da piperinadiisopropilamina). (1) cada e das amidas O susceptibilidade diplópodos ao extrato, àfoi piperina e às (isopentilamina, adamantilamina, N isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida oníveis composto nas Figuras 2ados aN 4. Entretanto, diferentes de que apresentou menor toxicidade para O. fuscipes na dose (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). sintéticas: isopentilpiperamida (2), adamantilpiperamida (3) e Figura 1: Fórmulas estruturais da piperina (1) e das amidas piperamidas foram observados. A mistura reacional foi mantida sob agitação, a 60ºC, que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose susceptibilidade dos diplópodos ao extrato, à piperina e às R' isopropilpiperamida (4). foi mantida testada. Comparando a toxicidade doOextrato e da piperina, A mistura reacional agitação, 60ºC, O sintéticas: (2),osob adamantilpiperamida durante 1,5isopentilpiperamida a 2,0 h. Em seguida, solvente e o aexcesso testada. piperamidas foram observados. (3) isopropilpiperamida (4) em durante 1,5 a 2,0 h.Obtenção Em seguida, o solvente erotatório. oo excesso 120 de 0,3 g (Figuras 2 e 3), observa-se(2) isopentil; R' = H (1) na dose queR o= primeiro da eamina foram O Etapa 2 -eliminados das evaporador piperamidas: resíduo 120 (3) R = adamantil; R' = H da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificouresíduona obtido em coluna de sílica para obtido etapa2foi1- fracionado foi dissolvido em THF secoo gel (4 mL) Etapa Obtenção das piperamidas: resíduo 100 (4) R = R'= isopropil resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para se 100 100 e 70% de mortalidade, respectivamente. Quanto às obtenção das piperamidas 2, 3 e 4 em puras. Emseco cada g de e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5(41mmol obtido nadas etapa 1 foi dissolvido THF obtenção piperamidas 2, 3 edistintas, 4 puras. Em cada 1amina gmL) de amidas g (Figura 80 sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,30,1g/mL dieta, foi adicionado, em etapas 1 mL de solução, (aproximadamente dois equivalentes) de cada Figura 1 e, a esta solução, foram adicionados cerca de 5solução, mmol 0,1g/mL 80 dieta, foi adicionado, em etapas distintas, 1 mL de 0,2g/mL pela 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, seguida do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). (aproximadamente dois equivalentes) de em cada amina 0,2g/mL 60 0,3g/mL do extrato dareacional pimenta-do-reino e da-1sob piperina diferentes Figura (%) de Orthoporus fuscipes, isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o0,3g/mL composto concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL . Para as piperamidas A mistura foi mantida agitação, a 60ºC, 60 1: Mortalidade (isopentilamina, adamantilamina, diisopropilamina). -1 Figura 1: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes, concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL . Para as piperamidas que apresentou a menor toxicidade para O. fuscipes na dose 2, mistura 3 e 4 1,5 foireacional o mesmo procedimento, entanto, durante autilizado 2,0 h. Em seguida, osob solvente eno o aexcesso submetidos a diferentes concentrações de extrato 40 A foi mantida agitação, 60ºC, 2, 3 e 4 foi utilizado o mesmo procedimento, no entanto, -1 submetidos a diferentes concentrações de extrato 40 testada. utilizou-se apenas soluções naem concentração 0,3 g.mL .O O da amina1,5foram evaporador durante a 2,0 eliminados h. Em seguida, o solvente0,3 erotatório. og.mL excesso -1 etanólico de Piper nigrum. Experimentos realizados à utilizou-se apenas soluções na concentração .O 20 de Piper nigrum. Experimentos realizados à 120 extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as resíduo obtido foi fracionado em coluna de sílica gel para etanólico da amina foram eliminados em evaporador rotatório. O 20 extrato bruto foi diluído em etanol (95%) e a piperina e as temperatura ambiente num período de 17 dias. piperamidas diluídas2,em obtenção dasforam piperamidas 3em eclorofórmio. 4coluna puras.deEm cadagel1 para g de resíduo obtido foi fracionado sílica temperatura ambiente num período de 17 dias. 1000 piperamidas foram diluídas em clorofórmio. de toxicidade dieta, foiTestes adicionado, em etapas mLcada de solução, 0 obtenção das piperamidas 2, 3 edistintas, 4 puras. 1Em 1 g de Testes de toxicidade Os testes de toxicidade consistiram na exposição do extrato da pimenta-do-reino e da piperina em diferentes -20 0,1g/mL 80 dieta, foiOs adicionado, em etapas distintas, 1 mL deexposição solução, testes de toxicidade consistiram napiperamidas -20 1 -1 3 5 7 9 11 13 15 17 0,2g/mL de O. fuscipes a tratamentos com dieta contendo: concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 g.mL . Para as do extrato da pimenta-do-reino e dacom piperina em diferentes 1 3 5 7 9 11 13 15 17 de O. fuscipes a tratamentos dieta contendo: 60 0,3g/mL -1da extrato etanólico de frutos pimenta-do-reino, 2, 3 e 4 foi utilizado o emesmo procedimento, no entanto, Figura 1: Mortalidade (%) deDias Orthoporus fuscipes, concentrações 0,1; 0,2de 0,3 g.mL . Para as piperamidas extrato etanólico frutos da pimenta-do-reino, Dias -1 piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e utilizou-se apenas soluções na concentração 0,3 g.mL . O 2, 3 e 4 foidiisopropilpiperamida, utilizado o mesmo procedimento, no entanto,e submetidos a diferentes concentrações de extrato 40 piperina, isopentilpiperamida Figura2.2:Porcentagem Porcentagem de mortalidade de Orthoporus adamantilpiperamida, naem temperutura de 25º ±piperina 1ºC, por-1e.um extrato bruto foi diluído etanol (95%) e a0,3 as Figura de mortalidade de Orthoporus fuscipes utilizou-se apenas soluções na concentração g.mL O Figura 2: Porcentagem deExperimentos mortalidade de Orthoporus adamantilpiperamida, na temperutura de 25º ± 1ºC, por um etanólico de Piper nigrum. realizados à de fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico período de 17 dias. Como recipientes-teste foram utilizados piperamidas foram diluídas em clorofórmio. 20 expostos a diferentes doses do extrato etanólico de frutos da extrato bruto foi diluído em etanol (95%) eforam a piperina e as fuscipes expostos a diferentes doses do extrato etanólico de Figura 2 período de 17 dias. Como recipientes-teste utilizados frutos da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias. temperatura ambiente num período de 17 dias. potes descartáveis de 250 mL. No início dos experimentos, Testes de toxicidade pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias. Figura 2 piperamidas foram diluídas em clorofórmio. frutos0da pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias. potes descartáveis de 250 mL. Noconsistiram início experimentos, em cada recipiente (n=10), forradodos com filtro Os testes deteste toxicidade napapel exposição Testes de toxicidade em cada recipiente (n=10),foiforrado com 1papel filtro umedecido com água destilada, adicionado diplópodo de O. Os fuscipes a teste tratamentos com dieta contendo: testes de toxicidade consistiram na1 diplópodo exposição -20 umedecido com água destilada, foi adicionado 0,1g/mL e 1 gO.de fuscipes alimento de 1 mLcom teste. O extrato etanólicoacrescido de frutos dada substância pimenta-do-reino, 3 5 7 9 11 13 15 17 100 1 de a tratamentos dieta contendo: 0,1g/mL 0,2g/mL epiperina, 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância teste. O 100 alimento consistiu numa mistura deda farelo de trigo e açúcar diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e 0,2g/mL extrato etanólico de frutos pimenta-do-reino, Dias 0,3g/mL alimento consistiu numa farelo de ±trigo açúcar 80 na proporção de 9:1. Para evitar oderessecamento dae por dieta, a adamantilpiperamida, na mistura temperutura de 25º 1ºC, um 0,3g/mL piperina, diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e 80 na proporção 9:1. Para recipientes-teste evitar o ressecamento da dieta,Os a cada 24 de h eram adicionadas 03 gotas de água destilada. período 17 de dias. Como foram utilizados Figura60 2: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus adamantilpiperamida, na temperutura de água 25º ±destilada. 1ºC, por um cada 24 h eram adicionadas 03 gotas de Os 60 expostos a diferentes doses do extrato etanólico de recipientes permaneceram tampados durante o período de potes descartáveis 250 recipientes-teste mL. No início dos experimentos, fuscipes período de 17 dias.de Como foram utilizados recipientes permaneceram tampados durante o período de 2 frutos40 daFigura pimenta-do-reino a 25 ± 1 ºC, por 17 dias. exposição, já que as tampas eram para propiciar em cada recipiente forrado com papel filtro potes descartáveis deteste 250 (n=10), mL. No perfuradas início dos experimentos, 40 exposição, já que as tampas eram perfuradas para propiciar a ventilação interna. Ao (n=10), longofoido teste com foi observada umedecido com águateste destilada, adicionado 1papel diplópodo em cada recipiente forrado filtroa 20 aemortalidade interna. Ao longo do teste foitratamento observada doságua organismos. Para cada 1ventilação g de alimento acrescido de 1foi mL da substância teste.foi Oa umedecido com destilada, adicionado 1 diplópodo 20 mortalidade dos organismos. Para cada tratamento foi 0,1g/mL um controle experimental. alimento consistiu numa mistura de farelo de trigo eteste. açúcar erealizado 1 g de alimento acrescido de 1 mL da substância O 1000 realizado um controle experimental. 0 0,2g/mL No ensaio realizado, o extrato etanólico dedaefrutos da na proporção de 9:1. Paramistura evitar oderessecamento dieta, a alimento consistiu numa farelo de trigo açúcar No ensaio realizado, o extrato etanólico de frutos da 0,3g/mL 80 pimenta-do-reino e9:1. a piperina foram testadas nas destilada. doses 0,1; Os 0,2 cada 24 h eram 03 gotas de água na proporção deadicionadas Para evitar o ressecamento da dieta, a pimenta-do-reino e aque piperina foram testadas nas doses 0,1; 0,2 1 3 5 7 9 11 13 15 17 e 0,324 g; henquanto as piperamidas (diisopropilpiperamida, recipientes permaneceram tampados durante o período de cada eram adicionadas 03 gotas de água destilada. Os 60 1 3 5 7 9 11 13 15 17 eexposição, 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida, Dias isopentilpiperamida adamantilpiperamida) avaliadas já que asetampas eram perfuradas para propiciar recipientes permaneceram tampados duranteforam o período de Dias isopentilpiperamida adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose 0,3 as g.eO extrato etanólico do fruto foi diluído em aexposição, ventilação interna. Ao longo do teste foi observada a 40 já que tampas eram perfuradas para propiciar Figura de mortalidade de Orthoporus fuscipes apenas na dose 0,3 O extrato do fruto foi diluídoP.A. em Figura3.3:Porcentagem Porcentagem de mortalidade de Orthoporus P.A. 95%dos e a g. piperina asetanólico piperamidas em clorofórmio mortalidade organismos. Para cada tratamento aetanol ventilação interna. Ao elongo do teste foi observadafoi a expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, por 17 dias. Figura 3: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus etanol P.A. um 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio fuscipes 20 expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, A toxicidade destes solventes para oPara O. fuscipes foi avaliada P.A. com realizado controle experimental. mortalidade dos organismos. cada tratamento foi fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, Figura 3 por 17 dias. Ao mesmo toxicidade destes solventes para O. foietanólico avaliada com Figura 3 volume utilizado para se oefetuar as diluições. ensaio realizado, o fuscipes extrato de realizado No um controle experimental. por 170dias. ofrutos mesmodavolume utilizado para se efetuar as diluições. a piperina foram testadas Nopimenta-do-reino ensaio realizado, oe extrato etanólico de frutos da nas doses 0,1; 0,2 0,3 g; foram enquanto quenas as doses piperamidas pimenta-do-reino e a epiperina testadas 0,1; 0,2 (diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida 1 3 5 7 9 11 13 15 17 e 0,3 g; enquanto que as piperamidas (diisopropilpiperamida,e adamantilpiperamida) foram avaliadas apenas na dose Dias isopentilpiperamida e adamantilpiperamida) foram avaliadas 0,3 g. na O dose extrato fruto foi etanol apenas 0,3 etanólico g. O extratodoetanólico do diluído fruto foi em diluído em Figura 3: Porcentagem de mortalidade de Orthoporus etanol P.A. 95% e a piperina e as piperamidas em clorofórmio P.A. diisopropilpiperamida fuscipes expostos a diferentes doses da piperina, a 25 ± 1ºC, 100 A toxicidade destes solventes para o O. fuscipes foi avaliada com diisopropilpiperamida Figura 3 isopentilpiperamida por 17100 dias. o mesmo volume utilizado para se efetuar as diluições. isopentilpiperamida 80 adamantilpiperamida 80

60 60

adamantilpiperamida

1

1

Figura 3

Boccardo L./Revista L./Revista Brasileira Brasileira de de Toxicologia Toxicologia 21, 21, n.1 n.1 (2008) (2008) Boccardo

42 36

Mortalidade (%)

100

no controle deste grupo moreletii, animal. foram oalternativa controle viável do diplópodo Ommatoiulus Assim, embora este estudo seja preliminar, oferece considerados pouco eficientes. importantes subsídios a condução de novos testes que Deste modo para pelos resultados apresentados e procurem a metodologia utilizada de maneira tais que devido às aprimorar características biológicas dos diplópodos, esta seatorne uma nova à disposição mercado, como presença de umtecnologia exoesqueleto rígido eno calcificado considerando este método e pouco impactante. que dificulta ser a utilização de seguro métodos de aplicação por

diisopropilpiperamida isopentilpiperamida

80

adamantilpiperamida

60 40 20 0

1

3

5

7

9

11

13

15

17

Dias

Figura 4. Porcentagem de mortalidade de Orthoporus fuscipes Figura 4: Mortalidade (%) de Orthoporus fuscipes, expostos à diisopropilpiperamida, isopentilpiperamida e submetidos a diferentes concentrações de extrato etanólico Figura 4 adamantilpiperamida na concentração de 0,3 g/mL, a 25 ± 1ºC, de Piper nigrum. Experimentos realizados à temperatura por 17 dias.

ambiente num período de 17 dias. Comparando a toxicidade do extrato e da piperina, Nos com que a dieta pura, na dose de 0,3 controles g (Figuras 2realizados e 3), observa-se o primeiro assim como nos controles realizados com os solventes foi mais tóxico, pois, após 4 dias de exposição verificou(etanol clorofórmio), não foirespectivamente. observada mortalidade se 100 ee 70% de mortalidade, Quantonos às organismos-teste. Tais resultados demonstram essas amidas sintéticas, cuja dose de exposição foi 0,3 que g (Figura condições experimentais não influenciaram naseguida mortalidade 4), a mais tóxica foi a diisopropilpiperamida, pela dos diplópodos. isopentilpiperamida. A adamantilpiperamida foi o composto Apesara da piperina ser opara principal constituinte, que apresentou menor toxicidade O. fuscipes na dose em termos quantitativos, do extrato etanólico de frutos da testada. pimenta-do-reino, esta não parece sercom a única responsável Nos controles realizados a dieta pura, pela atividade apresentada por este, uma vez que a assim como nos controles realizados com os substância solventes isolada e(mais concentrada no extrato) apresentou (etanol clorofórmio), não do foi que observada mortalidade nos menor atividade. Por outro lado, deve-se considerar que organismos-teste. Tais resultados demonstram que essas a piperina, agindo sinergicamente com outras substâncias condições experimentais não influenciaram na mortalidade presentes no extrato, possa ter potencializado a toxicidade dos diplópodos. deste. Entretanto, Paula (28) muito pouco se Apesar dasegundo piperina ser et o al. principal constituinte, sabe sobre a relação entre as estruturas das piperamidas as em termos quantitativos, do extrato etanólico de frutoseda suas respectivas atividades biológicas. pimenta-do-reino, esta não parece ser a única responsável Tentativas para encontrar umvez método seguro e pela atividade apresentada por este, uma que a substância eficaz no controle de diplópodos, foram feitas em várias isolada (mais concentrada do que no extrato) apresentou regiões do mundo. Mariconi (29) numa revisão descreveu menor atividade. Por outro lado, deve-se considerar que os inseticidas DDT, BHC, Clordane e Heptacloro, aque piperina, agindo sinergicamente com outras substâncias foram empregados para controle de diplópodos com presentes no extrato, possa ter potencializado a toxicidade sucesso, embora o mesmo autor tenha admitido que deste. Entretanto, segundo Paula et al. (28) muito pouco“há se quemsobre se queixe de que todos esses produtos não conduzam sabe a relação entre as estruturas das piperamidas e as a bons resultados”. Entretanto os produtos citados pelo suas respectivas atividades biológicas. autor, atualmente, tem sua utilização dados os Tentativas para encontrar um proibida método seguro e efeitos danosos que causam sobre o ambiente, o homem eficaz no controle de diplópodos, foram feitas em váriase os outros Austrália, Read (3) citaram regiões doanimais. mundo.Na Mariconi (29)Hopkin numa erevisão descreveu que os produtos Baygon e Baysol, apesar de utilizados para que os inseticidas DDT, BHC, Clordane e Heptacloro, o controle do diplópodo Ommatoiulus moreletii, foram foram empregados para controle de diplópodos com considerados pouco eficientes. sucesso, embora o mesmo autor tenha admitido que “há Deste modo pelosesses resultados quem se queixe de que todos produtosapresentados não conduzame devido às características biológicas dos diplópodos, tais a bons resultados”. Entretanto os produtos citados pelo como a presença de um exoesqueleto rígido e calcificado autor, atualmente, tem sua utilização proibida dados os que dificulta utilização métodos de aplicação efeitos danososa que causamde sobre o ambiente, o homempor e contato sugere-se, a utilização de iscas tóxicas os outros animais. Na Austrália, Hopkin e Read (3)contendo citaram extrato etanólicoBaygon bruto dee Baysol, frutos daapesar pimenta-do-reino que os produtos de utilizadoscomo para

contato sugere-se, a utilização de iscas tóxicas contendo extrato etanólico bruto de frutos da pimenta-do-reino como AGRADECImENTOS alternativa viável no controle deste grupo animal. Assim, embora estudo seja preliminar, oferece À Profa. Dra.este Carmem Sílvia Fontanetti do importantes subsídios para a condução de novos testes Departamento de Biologia da UNESP, Campus de que Rio procurem a metodologia de maneira que Claro, SP,aprimorar pela identificação dosutilizada diplópodos e ao Prof. esta se torne uma nova tecnologia à disposição no mercado, Dr. Luiz Cláudio de Almeida Barbosa pela cessão das considerando este método e poucode impactante. piperamidas ser sintetizadas no seguro Laboratório Análise e

Síntese de Agroquímicos – UFV.

AGRADECIMENTOS RESUmO

À Profa. Dra. Carmem Sílvia Fontanetti do A toxicidade do extrato etanólico da pimentaDepartamento de Biologia da UNESP, Campus de Rio do-reino (Piper nigrum), da piperina Claro, SP, pela identificação dos diplópodos ee aoamidas Prof. sintéticas: adamantilpiperamida, isopentilpiperamida 14 Luiz Cláudio Dr. de Almeida Barbosa pela cessão das e diisopropilpiperamida paradeo Análise diplópodo piperamidas sintetizadas foi no avaliada Laboratório e Orthoporus fuscipes. Os experimentos consistiram na Síntese de Agroquímicos – UFV. exposição dos organismos-teste a uma dieta de farelo de trigo e açúcar (9:1) a qual foi adicionada a substância teste em solução observando-se a mortalidade por um RESUMO período de 17 dias. Verificou-se na dose contendo 0,3 g do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e da A toxicidade do100% extrato da pimentadiisopropilpiperamida, de etanólico mortalidade após 04 do-reino nigrum), da piperinaA piperina e amidas e 14 dias (Piper de exposição, respectivamente. na sintéticas: concentração adamantilpiperamida, de 0,3 g causou 70% deisopentilpiperamida mortalidade após 4 edias, diisopropilpiperamida foidoavaliada para o diplópodo mantendo-se até o final período de exposição. Dessa Orthoporus Os experimentos consistiram forma, dentrefuscipes. os compostos testados, o extrato etanólico na do exposição dos organismos-teste a uma dieta de farelo de fruto da pimenta-do-reino foi considerado o mais eficiente trigo e açúcarno(9:1) a qual adicionadadea Orthoporus substância e promissor controle de foi populações teste em pois solução mortalidade por um fuscipes, foi oobservando-se que promoveuamaior porcentagem de período de 17 dias. Verificou-se nanum dosemenor contendo 0,3 de g mortalidade para o organismo-teste período do extrato etanólico de frutos da pimenta-do-reino e da exposição. diisopropilpiperamida, 100% de mortalidade após 04 e 14 dias de exposição, respectivamente. A piperina na Unitermos: diplopoda, controle populacional, pimenta-doconcentração de 0,3 g causou 70% de mortalidade após 4 reino dias, mantendo-se até o final do período de exposição. Dessa forma, dentre os compostos testados, o extrato etanólico do fruto da pimenta-do-reino foi considerado o mais eficiente REFERêNCIAS BIBLIOGRáFICAS e promissor no controle de populações de Orthoporus fuscipes, pois RL, foi o Golovatch que promoveu de 1. Hoffman SI, maior Adis porcentagem J, Morais JW. mortalidade para o organismo-teste num menor período de Myriapoda: Diplopoda. In: Amazonian Arachnida and exposição. Myriapoda. Moscow: Pensoft 2002. 505-534.

2. Ruppert EE, Barnes RD, Fox RS. Zoologia dos Unitermos: diplópoda, populacional, pimenta-doInvertebrados: uma controle abordagem funcional evolutiva. 7ª reino edição. São Paulo: Roca. 2005. 1145p. 3. Hopkin SP, Read HJ. The biology of millipedes. New York: Oxford University Press, 1992. 233p. 4. Anderson JM, Leonard MA. Tree root and macrofauna effects on nitrification and mineral nitrogen losses

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Hoffman RL, Golovatch SI, Adis J, Morais JW. Myriapoda: Diplopoda. In: Amazonian Arachnida and Myriapoda. Moscow: Pensoft 2002. 505-534. 2. Ruppert EE, Barnes RD, Fox RS. Zoologia dos Invertebrados: uma abordagem funcional evolutiva. 7ª edição. São Paulo: Roca. 2005. 1145p. 3. Hopkin SP, Read HJ. The biology of millipedes. New York: Oxford University Press, 1992. 233p. 4. Anderson JM, Leonard MA. Tree root and macrofauna effects on nitrification and mineral nitrogen losses from deciduous leaf litter. Rev Ecol Biol Sol 1988; 25(4):373 - 384. 5. Anderson JM, Leonard MA, Ineson P, Huish S. Faunal biomass: a key component of a general model of nitrogen mineralization. Soil Biol Biochem 1985; 17:735-737. 6. Boccardo L, Fernandes MN. Toxicidade do Carbamato Methiocarb para os diplópodos Gymnostreptus olivaceus e Plusioporus setiger. Rev Bras Toxicol 2000; 13(2):2933. 7. Boccardo L, Fernandes MN. Toxicity of the Deltamethrin Pyrethroid on neotropical millipedes, Gymnostreptus olivaceus and Plusioporus setiger. J Adv Zool 2001; 22(1):1-4. 8. Boccardo L, Penteado CHS, Juca-Chagas R. Swarming of millipedes, a new case noticed in the district of Patrocínio - MG - Brazil. J Adv Zool 1997; 18(1):62– 63. 9. Boccardo L, Juca-Chagas R, Penteado CHS. Migration and population outbreaks os milipedes in the cofee plantation, region of Alto Paranaíba, MG, Brazil. Holos Environment 2002; 2(2):220-223. 10. Barbosa LCA. Os pesticidas, o homem e o meio ambiente. Viçosa: Editora UFV; 2004. 215p. 11. Bernard et al. Insecticidal defenses of Piperaceae from the neotropics. J Chem Ecol 1995; 21(6):801–814. 12. Scott IM, Jensen H, Scott JG, Isman MB, Arnason JT, Philogéne BJR. Botanical insecticides for controlling agricultural pests: Piperamides and the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae). Arch Insect Biochem Physiol 2003; 54(4):212-225. 13. Scott et al. Efficacy of Piper (Piperaceae) extracts for controlo f common home and garden insect pests. J Econ Entomol 2004; 97(4):1390-1403. 14. Upadhyay RK, Jaismwal G. Evaluation on biological activities of Piper nigrum oil against Tribolium castaneum. Bull Insectol 2007; 60(1):57-60. 15. Navickiene DHM, Miranda JE, Bortoli SA, Kato MJ, Bolzani VS, Furlan M. Toxicity of extracts and isobutyl

37

amides from Piper tuberculatum: potent compounds with potential for control of the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis. Pest Manag Sci 2007; 63:399403. 16. Scott WP, McKibben GH. Toxicity of black pepper extract to boll weevils. J Econ Entomol 1978; 71(2):343344. 17. Miyakado M, Nakayama I, Ohno N. Insecticidal unsaturated isobutylamides. In: Arnason JT, Philogéne BJR, Morad P. (eds). Insecticidas of plant origin. ACS Symposium Series; 387. New York: Maple Press. 1989. 173-187. 18. Su HCF. Insecticidal properties of black pepper to rice weevils and cowpea weevils. J Econ Entomol 1977; 70(1):18-21. 19. Su HCF, Horvat R. Isolation, identification, and insecticidal properties of Piper nigrum amides. J Agric Food Chem 1981; 29:115-118. 20. Flores WL, Sampaio LS, Marques OM, Costa JA. Efeito dos extratos de pimenta-do-reino e cinamomo e do malation no controle do caruncho Zabrotes subfasciatus (Boheman, 1833) em sementes de feijão (Phaseolus vulgaris L.) armazenadas. Insecta 1993; 2(1):11-22. 21. Boff MIC, Almeida AA. Ação tóxica de extratos de Pimenta-do-reino, Piper nigrum, em ovos de Sitotroga cerealella (Oliv.) (Lepidoptera: Gelechiidae). An Soc Entomol Bras 1996; 25(3):423-429. 22. Ribeiro TS, Freire-de-Lima L, Previato JO, MendonçaPreviato L, Norton H, Lima MEF. Toxic effects of natural piperine and its derivates on epimastigotes and amastigotes of Trypanosoma cruzi. Bioorg Med Chem Letters 2004; 14:3555-3558. 23. Paula VF, Barbosa LCA, Demuner AJ, Piló-Veloso D, Picanço MC. Synthesis and insecticidal activity of new amide derivatives of piperine. Pest Manag Sci 2000; 56(2):168-174. 24. Ewete FK, Arnason JT, Durst T, Mackinnon S. Toxicity of gedunin, piperine and crude extracts of their natural products on growth and development of Ostrinia nubilalis Hubner (Lepidoptera: Pyralidae). Discov Innov 2000; 12:67-72. 25. Simas NK, Lima EC, Kuster RM, Lage CLS, Filho AMO. Potential use of Piper nigrum ethanol extract against pyrethroid-resistant Aedes aegypti larvae. Rev Soc Bras Med Trop 2007; 40(4):405-407. 26. Park IK, Lee SG, Shin SC, Park JD, Ahn YJ. Larvicidal activity of isobutilamides identified in Piper nigrum fruits against three mosquito species. J Agric Food Chem 2002; 50:1866-1870. 27. Ikan, R. Natural Products: a laboratory Guide. 2ª edition. San Diego: Academic Press. 1991. 360p.

38

Boccardo L./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)

28. Paula VF, Barbosa LCA, Piló-Veloso D, Picanço M. Toxicidade de amidas derivadas da piperina a Ascia monuste orseis (Godart) (Lepidoptera: Peiridae). Rev Bras Entomol 2001; 45(1):7-10. 29. Mariconi FAM. Inseticidas e seu emprego no controle de pragas, TOMO I: Defensivos. 7ª ed. São Paulo: Nobel Editora, 1988. 126p.