UES FQF Ciclo II 2016 Practica No 7 HPLC

ANALISIS INSTRUMENTAL

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TEMA: CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (H.P.L.C) 7.1

GENERALIDADES La cromatografía líquida de alta eficiencia utiliza instrumental muy distinto a la cromatografía líquida ¨clásica¨. En la cromatografía líquida de alta eficiencia se usan columnas de diámetro muy reducido, por ejemplo 2 mm rellenas de materiales especiales, cuyas partículas tienen un tamaño de 30 a 40 m. y en ocasiones, hasta 10 m. Este tipo de columna es muy eficaz, pero ofrece gran resistencia al flujo de la fase móvil o sea una gran caída de presión (hasta 400 atm.) que hagan fluir la fase móvil a una velocidad razonable a través de la columna. La cantidad de fase estacionaria dentro de la columna es pequeña, por lo que se requiere que la muestra sea también pequeña, entre 1 y 10 mg La muestra se introduce en la cámara de inyección mediante una jeringa o válvula de inyección. Un detector, colocado a la salida de la columna, proporcionan un registro continúo de la composición del líquido que sale, esto permite obtener un registro llamado: cromatograma. El área bajo la señal en el cromatograma es proporcional a la cantidad de soluto contenido en la zona eluída. Un análisis cuantitativo involucra la medición de esta área y el establecimiento de una proporcionalidad. El área de una señal puede determinarse de varias formas. La más simple es medir su altura, ya que una señal simétrica puede aproximarse a un triángulo y la altura es proporcional a su área. Este método es rápido y preciso, aunque su exactitud depende del tiempo y que la forma de la señal permanezca constante a medida que la muestra cambia. La otra aproximación es estimar el área como la mitad del producto del ancho por lo alto de la señal; este método también aproxima a un triángulo. También puede mencionarse el método de pesada, planímetro o lo más moderno, un sistema automático en el cual el área es determinada con una computadora. Conocidos estos métodos de medición de área es necesario convertir el área a la cantidad o porcentaje del componente en la muestra.

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CAMPO DE APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA. Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles, y sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen: los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleídos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies órgano metálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas.

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PARTE EXPERIMENTAL EQUIPO HPLC. AGILENT 1100 SERIES. Con las siguientes especificaciones cromatográficas Columna : ZORBAX Eclipse XBD-C8 Detector : UV-VIS. ( Variable) y Lámpara de Deuterio. Columna : C18 Velocidad de flujo : 1.5 mL / min. Bomba : Isocrática, - Rango de flujo de 0.001 a 10mL/min, - rango de presión de 0-5880 PSI. Fase móvil : Preparar una mezcla desgasificada de metanol y agua (50:50). Muestra : Tabletas de Acetaminofén Longitud de onda :  = 247 nm Inyector : Manual Loop : 50 L

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PROCEDIMIENTO DE OPERACIÓN DEL SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC) 7.4.1 PREPARACION DEL SISTEMA DE HPLC A. Preparar baño maría según sigue a continuación: i. Llenar el baño maría de la unidad Precitherm PFV con agua destilada hasta que el nivel del agua cubra completamente la columna cromatográfica y hasta 3 cm del borde. ii. Encender la unidad Precitherm PFV iii. Programar el selector de temperaturas a 25 ºC o según el procedimiento. iv. Cuando el baño maría ha alcanzado la temperatura programada la lámpara de control de temperatura fija (lámpara amarilla) se enciende intermitentemente y la de control de temperatura (lámpara verde) se mantiene encendida. Nota: esto se realiza para favorecer la separación de los componentes de la muestra B. Encender la computadora activando los siguientes componentes en este orden:  Pulsar el botón de encendido del UPS.  Pulsar el botón de encendido del CPU.  Pulsar el botón de encendido del Monitor. C. Dejar cargar el sistema operativo y el servidor de la red creada para el funcionamiento del equipo de HPLC, el programa se llama CAG Bootp Server. D. Encender los módulos que componen el HPLC en el siguiente orden:  Pulsar el botón de encendido de la bomba.  Pulsar el botón de encendido del detector. E. Inicializar el programa Instrument 1 On Line para realizar el análisis de una muestra o Instrumen 1 Off Line para el análisis de datos recabados de una determinación anteriormente guardada en el sistema los cuales tienen iconos de acceso directo en la pantalla principal del monitor.

Al utilizar Instrument 1 On Line se controla por la computadora las siguientes funciones del sistema: a) Funcionamiento y configuración de la Bomba. b) Funcionamiento y configuración del Detector. c) Integración y Análisis de los datos obtenidos. d) Impresión de los cromatogramas.

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e) Diagnóstico rápido del programa.

F.

G.

H. I. J. K.

Nota: Para efectuar la configuración del sistema ver el procedimiento del programa Purgar la fase móvil (ver procedimiento general para preparación de fase móvil) preparada para evitar la presencia de burbujas que puedan ingresar al sistema de Cromatografía; esto se realiza configurando primero la bomba a un flujo de 5 ml/min y luego se abre la perilla de la válvula activa color negro, que sobresale del módulo de la bomba, manualmente hasta que este floja. Permitir que la fase móvil corra al flujo programado, encendiendo directamente la bomba desde la terminal de computadora (icono de la bomba en encendido) por 5 minutos (la presión de la bomba en este paso debe ser en el intervalo de 0 a 1 Bar. Después de transcurrido el tiempo se apaga la bomba desde la terminal de computadora y se cierra la perilla de purga de la bomba manualmente hasta que quede ajustada. Se programa la bomba al flujo de trabajo determinado para la columna (para la columna Zorbax Eclipse XDB-C8 el flujo máximo es de 2 ml/min por lo que se debe mantener entre 1 a 1.5 ml/min). Programar el detector a la longitud de onda de trabajo según especificación del procedimiento. Encender la bomba previamente programada al flujo de trabajo y se deja correr la fase móvil por 15 minutos para permitir que el sistema de Cromatografía se estabilice. Encender el detector a la longitud de onda programada.

7.4.2 PROCEDIMIENTO DE ANALISIS EN HPLC a. Preparación del estándar: Realizar procedimiento según lo especificado en la preparación de estándar de un principio activo o de un analito de interés de un libro oficial (USP, ASTM, AOAC, etc.), teniendo los siguientes cuidados i. Pesar la cantidad respectiva del principio activo. ii. Disolverlo con la fase móvil correspondiente. iii. Transferir a un frasco volumétrico llevando a volumen con la fase móvil. iv. Hacer pasar la solución del estándar por un filtro 0.45 m de porosidad. v. Mantener la solución filtrada en un frasco volumétrico. b. Verificar que la válvula de inyección manual se encuentre cerrado en la posición de carga ”Load”. c. Se procede a la ambientación de una jeringa descartable de 5 ml con el estándar preparado y filtrado y desgasificado, luego se llena más allá de la marca de 5 ml y se eliminan las burbujas que pueda contener con leves golpes en la pared de la jeringa y obturación del embolo hasta que salgan unas gotas del estándar a través de la aguja. NOTA: Para este paso también se puede ocupar una jeringa provista por el fabricante d. Colocar la aguja de inyección HPLC que está provista en el equipo luego se oprime el embolo hasta que el estándar haya ambientado la aguja por dentro y fuera. e. Se procede a llenar el Loop de inyección del equipo, de 50 L de capacidad, ubicado en el inyector manual, en posición de “carga” hasta que haya pasado parte de la muestra al frasco de rebalse. f. Luego del tiempo de estabilización (ver paso 9.4.1-j.) se procede al encendido del detector desde la computadora para alistar el sistema. g. Luego de transcurridos los 15 minutos de estabilización del sistema se procede a inyectar el estándar colocando la manivela del inyector manual abierto en posición de “inject”. h. Se deja correr el cromatograma del estándar. i. Se guardan los datos obtenidos en la memoria de la computadora para futuras comparaciones e identificaciones. j. Regresar la manivela del inyector manual a la posición de carga y se retira la jeringa.

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k.

Preparación de la muestra: La muestra se prepara según especificaciones del libro oficial tomándose en cuenta lo siguiente: Antes de inyectar la muestra debe hacerse pasar a través de un filtro de una porosidad de 0.45 m, utilizando una jeringa descartable. l. Se toma la muestra con una jeringa descartable de 5 ml. m. Verificar que la válvula de inyección manual se encuentre en la posición de “carga”. n. Se procede a la ambientación de una jeringa descartable de 5 ml con la muestra filtrada, luego se llena más allá de la marca de 5 ml y se eliminan las burbujas que pueda contener con leves golpes en la pared de la jeringa y obturación del embolo. NOTA: Para este paso también se puede ocupar una jeringa provista por el fabricante o. Colocar la aguja de inyección que está provista en el equipo luego se oprime el embolo hasta que la muestra haya ambientado la aguja por dentro y fuera. (nota: entre cada carga de la válvula de inyección se debe lavar adecuadamente la aguja con la fase móvil). p. Se procede a llenar el Loop de inyección del equipo, de 50 L de capacidad, ubicado en el inyector manual, en posición de “carga” hasta que haya pasado parte de la muestra al frasco de rebalse. q. Mover la manivela a posición “INJECT”, se procede a la inyección de la muestra al sistema de HPLC. r. Se obtiene el cromatograma en el cual se identifican, cualifican y cuantifican los componentes de la muestra en base al estándar analizado con anterioridad s. Al terminar el análisis se procede a apagar primero el detector, la bomba y al lavado del sistema. 7.4.3 a.

LAVADO DEL SISTEMA DE CROMATOGRAFÍA. Colocar en el lugar de la fase móvil agua calidad HPLC filtrado a través de poro de 0.45 m y desgasificado, lavando el filtro de entrada de la fase móvil con agua HPLC. b. Purgar el sistema abriendo la perilla de purga de la bomba manualmente hasta que quede floja. c. Configurar la bomba a un flujo de 5 ml/min. d. Encender la bomba. e. Dejar que corra el agua por 5 minutos. f. Apagar la bomba g. Cerrar la perilla de purga de la bomba. h. Configurar el flujo de la bomba a 1 ml/min i. Encender la bomba dejando que el agua corra por el sistema por 30 minutos j. Apagar la bomba k. Cambiar el agua HPLC por una mezcla Metanol/agua (ambos calidad HPLC) en Proporción de 50:50 filtrado a través de poro de 0.45 m y desgasificado, lavando el filtro de entrada de la fase con la mezcla Metanol/agua 50:50. l. Proceder a la purga del sistema abriendo por completo la perilla de purga de la bomba y configurando el flujo a 5 ml/min. m. Encender la bomba y dejar correr por 5 minutos. n. Luego de pasado el tiempo se procede a apagar la bomba, se cierra la perilla de purga de la bomba y se procede a configurar el flujo de la mezcla a 1 ml/min. o. Encender la bomba, y lavar con la mezcla por 30 minutos. p. Apagar la bomba. q. Realizar el último lavado colocando en lugar de la mezcla metanol/agua el reactivo metanol calidad HPLC filtrado a través de poro de 0.45 m y desgasificado, lavando el filtro de entrada de la fase móvil con metanol grado HPLC. r. Proceder a la purga del sistema abriendo por completo la perilla de purga de la bomba. s. Configurar el flujo de la fase móvil a 5 ml/min, y encender la bomba por 5 minutos. t. Apagar la bomba y configurar el sistema a 1 ml/min

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Cerrar la perilla de purga de la bomba y encender la bomba dejando transcurrir un tiempo de lavado de 30 minutos. Al terminar el tiempo de lavado se apaga la bomba  Apagar los módulos del sistema HPLC  Cerrar el programa del sistema HPLC y el servidor  Apagar el sistema de cómputo desde el botón de inicio del sistema operativo eligiendo la opción “apagar equipo”.  Apagar el UPS manteniendo presionado el botón de encendido.

Notas: -

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El filtro colocado en el reservorio de la fase móvil debe quedar cubierto completamente en metanol HPLC, y nunca debe dejarse secar en alguna determinación. Si la muestra a analizar y el estándar de esta deben acidificarse o analizarse en medio ácido, el tal debe ser ácido fosfórico o ácido acético ya que el uso de ácidos fuertes como el ácido sulfúrico o el ácido clorhídrico atacan el acero inoxidable con el cual está fabricado el equipo HPLC, si la especificación de una marcha analítica expresa el uso de los ácidos mencionados anteriormente debe hacerse el cambio respectivo La columna del sistema HPLC debe lavarse después de cada análisis y nunca debe quedar con agua, sino que se debe terminar el lavado hasta que quede metanol HPLC por ultimo.

7.5 ANALISIS DE ACETAMINOFEN EN TABLETAS: Cada tableta rotula 500 mg de cafeína (Anexar cromatogramas al reporte de laboratorio y calcular con los datos obtenidos, el número de platos teóricos) A. PREPARACION DEL ESTANDAR: Pesar exactamente 25.0mg de estándar de Acetaminofen USP, en beacker, disolver en 5 mL de metanol HPLC y trasladar a un balón de 10.0 mL llevar a volumen con agua. Trasladar una alícuota de 1 mL hacia un balón de 10 mL y llevar a volumen con fase móvil, trasladar una alícuota de 1 mL hacia un balón de 10 mL y llevar a volumen con fase móvil. B. PREPARACION DE LA MUESTRA: OBTENCION DE LA SOLUCIÓN MADRE - Pesar individualmente 10 tabletas de Acetaminofén (peso total de las 10 tabletas 5.1663 g) y pulverizar en mortero. - Pesar el equivalente de 250 mg de PA en un beacker - Proceder a extraer el principio activo con fase móvil (50 mL) durante media hora en reposo. - Filtrar y trasladar hacia un balón volumétrico de 100 mL y llevar a volumen con fase móvil. - Tomar el volumen necesario de la solución madre y diluir hasta una concentración similar al estándar preparado. C. -

REPORTAR: Concentración del Estándar Peso promedio de las tabletas de Acetaminofen Propuesta de dilución de la muestra y Factor de dilución Numero de platos teóricos del pico del principio activo con la información del cromatograma Concentración de la muestra en la última dilución Cantidad de principio activo en el la alícuota de solución madre Cantidad de principio activo en el peso de muestra % sobre lo rotulado

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El cálculo de los platos teóricos del cromatograma del estándar obtenido (utilice la información reportada en el informe obtenido).

DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO PARA EL ANALISIS DE ACETAMINOFEN POR HPLC i. EQUILIBRIO Y ESTABILIZACIÓN DEL CROMATÓGRAFO LÍQUIDO Encender UPS

Encender CPU

Encender MONITOR

Configurar la velocidad de flujo de la bomba a 5 ml/min

Abrir perilla de purga (color negro) de la BOMBA

Hacer funcionar BOMBA (en monitor) por 5 minutos

Encender BOMBA (en monitor) estabilizar por 15 minutos

Encender cromatógrafo: A. BOMBA B. DETECTOR

Apagar la BOMBA

Cerrar la perilla de purga de fase en la BOMBA

Configurar las condiciones del método de detección: - Detector a 254 nm - Velocidad de flujo 1.5 mL/min

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ii. DESPUES DE CUMPLIR EL TIEMPO DE EQUILIBRIO Cargar muestra (Posición del inyector en LOAD)

Estabilizar por 10 minutos

Encender DETECTOR

Inyectar muestra (Posición del inyector en INJECT)

Apagar BOMBA y detector (en monitor)

Correr fase móvil por 5 minutos

Obtención de cromatograma

Obtener impresión del cromatograma

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iii. LAVADO DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO Orden del lavado del sistema de cromatografía: b. Agua HPLC c. Agua/Metanol 50:50 d. Metanol HPLC Lavar el filtro del reservorio con la FASE DE LAVADO (a.)

Abrir perilla de purga (color negro) de la BOMBA

Encender BOMBA y dejarla funcionar por 5 minutos

Colocar filtro en reservorio que contiene FASE DE LAVADO (a.)

Configurar la bomba a una velocidad de flujo: 5 mL/min

Apagar la bomba después de finalización del tiempo

Configurar la bomba a una velocidad de flujo: 1.5 mL/min

Cerrar perilla de purga (color negro) de la BOMBA

Lavar con Fase de lavado (a.) encendiendo la BOMBA por 30 minutos

Apagar la BOMBA

Repetir 2 veces más con las fases de lavado b. y c. En el último proceso de lavado la columna cromatográfica debe quedar llena con METANOL HPLC

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UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA DEPARTAMENTO DE ANALSIS QUIMICO E INSTRUMENTAL SECCION DE QUIMICA ANALITICA III HOJA DE RESULTADOS Nombres: Docente responsable: Nombre de la Práctica:

Fecha:

Datos de Estándar:

Datos de Muestra:

Peso de Estándar:

Peso Muestra:

Esquema de Dilución de Estándar:

Esquema de Dilución de Muestra:

Concentración de Estándar:

Factor de Dilución de Muestra:

Resultados obtenidos: 10%

Cálculos: 20%

Observaciones: 10% Conclusiones: 20%

Dictamen: 20%

Bibliografía: 10%

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