USO DE ESFERAS DE INOX NA MACERAÇÃO DE TECIDOS FOLIARES DE ALGODOEIRO DESTINADOS A PURIFICAÇÃO DE DNA (*) Carlos Eduardo Araújo Batista (Embrapa - UEPB), Rafaela L. Araújo (Embrapa - UEPB), Lúcia Vieira Hoffmann (Embrapa Algodão), Edina Moresco (Facual), Paulo Augusto Vianna Barroso (Embrapa Algodão /
[email protected]) RESUMO - Este trabalho descreve o uso de esferas de aço inox na maceração de tecidos foliares de algodão. Dentro de microtubo com capacidade para 2ml foi colocado 50 a 100mg de tecido foliar de algodoeiro e uma esfera de aço inox de 6mm de diâmetro. Um conjunto de 16 tubos foi imerso em nitrogênio líquido, colocados dentro de uma caixa plástica para armazenamento de microtubos e agitados manualmente. Após cerca de 30 segundos de agitação, as esferas foram retiradas e o procedimento de purificação do DNA foi realizado de modo usual. O DNA purificado segundo o procedimento descrito apresentou qualidade e quantidade similares às obtidas pelo procedimento convencional e reduziu o tempo necessário para processar o mesmo número de amostras. Palavras-chave: purificação de DNA, marcadores moleculares, algodoeiro. COTTON LEAF TISSUES FAST GRIND TO DNA PURIFICATION ABSTRACT - An inox steel sphere and 50-100mg of cotton leaf tissue were put in a 2ml microtube. A set of 16 microtubes was frozen at liquid nitrogen, was put in a plastic box and agitated by 30 seconds, approximately. After take of the sphere, the powdered tissue was used to purify the DNA. DNA produced was qualitative and quantitative similar to DNAs obtained by conventional grind procedures and able to be amplified by PCR and restricted by Eco RI. The sphere process is less time consuming, improving the efficiency of DNA purification. Key words: DNA purification; molecular markers; cotton. INTRODUÇÃO Um dos mais promissores usos dos marcadores moleculares é a seleção assistida por marcadores. Segundo este processo, a seleção de caracteres cuja expressão é de difícil mensuração seria realizada, ao menos em parte, por meio de marcadores intimamente ligados aos genes que controlam a característica (BARROSO e HOFFMANN, 2003). Um laboratório que deseje realizar este procedimento deve ser capaz de processar grande quantidade de amostras em tempo reduzido. Para isto, deve contar com métodos eficientes e rápidos em todas as etapas do processo de genotipagem via marcadores. Um dos principais gargalos encontrados na maioria dos laboratórios é a lentidão com que o DNA de diferentes genótipos pode ser processado. Boa parte da lentidão deve-se ao modo com que os tecidos foliares são triturados, passo fundamental para que o DNA contido nas células passe para a solução usada na extração. De modo geral, as amostras são trituradas individualmente, consumindo até 5 minutos por amostra. Equipamentos especialmente desenvolvidos para a maceração em maior escala de tecidos vegetais podem ser adquiridos junto a diversos fabricantes. Contudo, o custo destes equipamentos é proibitivo para a maioria dos laboratórios brasileiros.
Este trabalho descreve um método que permite realizar a purificação do DNA total de 16 ou mais amostras simultaneamente, de modo prático, rápido e barato. MATERIAL E MÉTODOS Cerca de 50 a 100mg de tecido foliar de algodoeiro foi colocado no interior de um microtubo de 2mL. Dentro do tubo foi colocada uma esfera de aço inoxidável de 6mm de diâmetro. Conjuntos de 16 tubos foram imersos em nitrogênio líquido e, a seguir, colocados dentro de uma caixa plástica com tampa para armazenamento de microtubos. A caixa com os microtubos foi agitada por cerca de 30 segundos para macerar as amostras. As esferas foram retiradas dos tubos e as amostras foram processadas para a purificação do DNA segundo a metodologia usualmente utilizada no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão (VIDAL et al., 2003). Amostras pertencentes a 60 genótipos foram processadas segundo a metodologia descrita. O DNA foi quantificado por meio da comparação da intensidade de fluorescência de quantidades conhecidas do DNA do fago lambda, em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo. A capacidade do DNA extraído de ser digerido por Eco RI e amplificado por PCR foram usados como avaliadores da qualidade do DNA produzido. RESULTADOS E DISCUSSÃO A quantidade de DNA extraído por amostra realizando a maceração com as esferas de aço inox foi similar à geralmente obtida com o procedimento convencional usado no Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão (Tab. 1). Os maiores valores obtidos foram 60 µg por purificação e o menor 10 µg, com média de 48 µg e o desvio padrão de 9,6 µg.
Tabela 1. Quantidade de DNA (em µg) extraído das amostras maceradas segundo o método das esferas. Amostra Quantid Amostra Quantid Amostra Quantid Amostra Quantid Amostra Quantid 1 50 13 20 25 60 37 50 49 60 2 50 14 50 26 60 38 40 50 50 3 50 15 40 27 50 39 40 51 30 4 50 16 50 28 50 40 50 52 30 5 50 17 60 29 50 41 50 53 30 6 50 18 60 30 40 42 60 54 50 7 50 19 60 31 50 43 50 55 50 8 50 20 50 32 10 44 50 56 50 9 40 21 60 33 50 45 50 57 50 10 40 22 50 34 50 46 50 58 50 11 30 23 60 35 50 47 50 59 50 12 50 24 50 36 50 48 60 60 50
A qualidade do DNA obtido também foi semelhante à obtida com a metodologia convencional. Não foram observadas degradações visíveis nos géis de agarose e todas as digestões realizadas
foram bem sucedidas. Os DNAs também foram moldes eficientes para a amplificação de marcadores SSR. O tempo gasto para macerar conjuntos de 16 amostras foi menor que cinco minutos, incluindo o tempo para colocar e retirar as esferas dos microtubos. Este é o tempo geralmente necessário para processar uma única amostra com o método usado convencionalmente. Esta significativa redução no tempo de processamento da amostras resulta em maior eficiência no uso dos demais equipamentos e, principalmente, de mão-de-obra. Todos estes fatores associados resultam em melhor aproveitamento dos recursos materiais e humanos disponíveis, reduzindo custos e aumentando a eficiência do laboratório. As esferas podem ser reaproveitadas inúmeras vezes desde que o DNA da amostra anterior seja adequadamente retirado. A descontaminação pode ser feita segundo os mesmos procedimentos usados nos pistilos. No Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão, a descontaminação é realizada pela lavagem com água e detergente seguida pela imersão em etanol por 30 minutos. A implantação do método depende exclusivamente da compra das esferas de aço inoxidável, que podem ser adquiridas junto a empresas especializadas na comercialização de esferas. O custo das esferas é baixo, menos de R$1,00 a unidade, portanto ao alcance de qualquer laboratório.
CONCLUSÃO O uso das esferas de aço inox permite macerar tecidos foliares de algodoeiro de modo adequado para a realização de purificações de DNA, reduzindo o tempo necessário para realizar a maceração e gerando soluções de DNA com concentração e qualidade similares às obtidas segundo outros métodos. (*) Trabalho desenvolvido com recursos do Banco do Nordeste e da Embrapa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS VIDAL, M. S.; COUTINHO, T. de C.; HOFFMANN, L. V. Comparação entre protocolos de extração de DNA de algodão para emprego em ensaios com marcadores moleculares. Campina Grande: Embrapa Algodão, 2003. (Circular técnica, 74). BARROSO, P. A. V.; HOFFMANN, L. V. Métodos de predição do comportamento de populações de melhoramento. Campina Grande: Embrapa Algodão, 2003. 38 p. (Comunicado Técnico, 108).
