XII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP
USO DO 2,3,5 CLORETO DE TRIFENILTETRAZÓLIO NA ESTIMATIVA DA VIABILIDADE POLINICA DE ALGODÃO-BRAVO USE OF TTC (2, 3, 5 TRIFENILTETRAZÓLIO CHLORIDE) IN THE ESTIMATING FEASIBILITY POLLEN OF COTTON-ANGRY Jenifer Fernanda Damasio(1) Vanessa dos Santos de Mello(1) Isane Vera Karsburg(2) Bruna Natália Veloso dos Santos(3) Weslaine de Almeida Macedo(4) Douglas Machado Leite(5) Lorena Cristina Batista dos Santos(6)
Resumo Ipomoea carnea, é um arbusto leitoso, conhecida popularmente como canudo e algodão-bravo. Possui efeito tóxico quando ingerida por bovinos e caprinos, tal efeito é devido a dois alcalóides: suainsonina e calesteginas, além de serem empregados como agentes anticancerígenos, antitumoral-proliferativos, antimetastáticos e anti-reumático por possuírem capacidade de inibir glicosidases e manosidases. O presente estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade polínica de uma população de Ipomea Carnea de Alta Floresta-MT, com o uso de 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazolio (TTC), em quatro horários de exposição do pólen ao corante. Na estimativa da viabilidade polínica foram comparados a eficiência de duas concentrações de TTC: 0,30% e 0,075%, em quatro horários de exposição do pólen ao corante: 6, 12, 18 e 24 horas, a fim de investigar qual era a concentração e horário de exposição mais eficiente na estimativa da viabilidade polínica. As lâminas foram preparadas pelo método de esmagamento. Analisaram-se 300 grãos de pólen por lâmina. Independente da concentração e tempo de exposição, o TTC se mostrou eficiente na determinação da viabilidade polínica de Ipomea carnea, sendo a média percentual de viabilidade maior que 70%. A concentração de 0,30% por 12 horas de exposição se mostrou mais eficiente por corar com uma coloração mais intensa e distinguir mais facilmente os polens viáveis dos inviáveis. Palavras-chaves: alcalóides, corante, grãos de pólen.
_____________________________________________________________________________________ 1 Mestrandas do Programa de Pós Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas da Universidade do Estado de Mato Grosso; email:
[email protected]; 2 Professora adjunta do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Estado de Mato Grosso; 3 Graduandas do curso de licenciatura plena e bacharelado em Ciências biológicas da Universidade do Estado de Mato Grosso; 4 Graduando do curso de bacharelado em Engenharia Florestal da Universidade do Estado de Mato Grosso; 5 Bióloga, docente da escola Estadual Vitoria Furlani da Riva.
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 8, n.1, 2016. Número especial 2.
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Abstract Ipomoea carnea, it is a milky bush, popularly known as straw and cotton-angry. It has toxic effects when ingested by cows and goat, such an effect is due to two alkaloids: swainsonine and calesteginas, besides being used as anticancer agents, antiproliferative antitumor, antimetastatic and anti-rheumatic by possessing capacity to inhibit glycosidases and mannosidases. This study aimed to evaluate the pollen viability of a population of Ipomoea carnea Alta Floresta-MT, with the use of 2,3,5triphenyltetrazolium chloride (TTC) in four pollen exposure times to dye. In estimating pollen viability were compared efficiency TTC two concentrations: 0.30% and 0.075% in four hours pollen exposure to the dye: 6, 12, 18 and 24 hours in order to investigate what was the concentration and more efficient exposure time in the estimation of pollen viability. Slides were prepared by crushing method. They analyzed 300 pollen grains per slide. Regardless of the concentration and exposure time, the TTC was efficient in determining pollen viability of Ipomoea carnea, the average percentage of viability was greater than 70%. Keywords: alkaloids,dye, pollen grains.
1. Introdução Ipomoea carnea é um arbusto leitoso, pouco ramificado, de caules ocos, pertencente à família das Convolvulaceae, encontrada em diversas regiões do Brasil, onde é conhecida popularmente como canudo, algodão-bravo emata-cabra. Possui efeito tóxico quando ingerida por bovinos e caprinos, tal efeito é devido a dois alcalóides: suainsonina e calesteginas, além de serem empregados como agentes anticancerígenos, antitumoral-proliferativos, antimetastáticos e anti-reumático por possuírem capacidade de inibir glicosidases e manosidases (SCHWARZ et al., 2003). A viabilidade dos grãos de pólen pode ser estimada por vários métodos colorimétricos, utilizando corantes, entre os quais os mais utilizados destacam-se o carmim acético, solução de lugol, azul de algodão, solução tripla de Alexander e 2,3,5 cloreto de trifeniltetrazólio, os quais promovem diferenças na coloração dos grãos de pólen fornecendo resultados de forma rápida e com baixo custo (SHARMA & SHARMA, 1994). O presente estudo teve como objetivo avaliar a viabilidade polínica de uma população de Ipomea Carnea de Alta Floresta-MT, com o uso de 2,3,5-cloreto de trifeniltetrazolio (TTC), em quatro horários de exposição do pólen ao corante nas concentrações de 0,075% e 0,30%.
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2. Metodologia O trabalho foi realizado no Laboratório de Citogenética e Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus de Alta Floresta - MT, no ano de 2016. Foram utilizadas grãos de pólen de flores em pré-antese de uma população de Ipomea carnea de Alta Floresta-MT. Na estimativa da viabilidade polínica foram comparados a eficiência de duas concentrações de TTC: 0,30% e 0,075%, em quatro horários de exposição do pólen ao corante: 6, 12, 18 e 24 horas, investigar qual era a concentração e horário de exposição mais eficiente na estimativa da viabilidade polínica da espécie. A viabilidade foi determinada pela capacidade de coloração dos grãos de pólen, onde foram considerados viáveis os pólens que apresentaram coloração da exine e da intine ou protoplasma bem definido e inviáveis aqueles que apresentaram exine corada, ausência de coloração e/ou ausência de protoplasma. No preparo das lâminas as anteras foram cortadas transversalmente com o auxílio de um bisturi, para à liberação dos grãos de pólen, as anteras foram maceradas levemente com um bastão de vidro, sobre uma gota do corante testado. Após o material foi coberto com uma lamínula e observado ao microscópio. A fim de se obter uma amostragem ao acaso dos grãos de pólen corados, foi utilizado o método de varredura, sendo contabilizados 300 grãos de pólen/lâmina com 5 repetições cada, perfazendo um total de 1500 grãos de pólen para cada corante investigado. Todas as lâminas foram observadas sob microscópio óptico na objetiva de 40x e as imagens foram digitalizadas utilizando o fotomicroscópio Leica, acoplado à câmera digital. Com a contagem obtida em cada corante, calculou-se a percentagem de polens viáveis. Para a comparação entre as concentrações e horários, os resultados da estimativa da viabilidade polínica foram submetidos à análise de variância pelo teste Tukey em nível de 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa Estatístico Sisvar ® (FERREIRA, 2011).
3. Resultados e Discussões Independente da concentração e tempo de exposição a taxa de viabilidade polínica de I. carnea foi acima de 71% (Tabela 1). Segundo Souza (2002), valores de viabilidade polínica acima de 70% são considerados como alta viabilidade do pólen, de 31 a 69% como média e até 30%, baixa. Com base nessa afirmação, e de acordo com os resultados obtidos, a população avaliada apresentou viabilidade alta.
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XII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP TABELA 1- Taxa média percentual de viabilidade polínica, com uso de TTC em duas concentrações: 0,30% e 0,075% e quatro tempos de exposição dos polens ao corante. Tempos Testes 6h 12h 18h 24h TTC 0,30%
83,06 Ba
93,86 Aa
90,66 Ba
45,73 b
TTC 0,075%
71,13 Bb
77,53 Bb
72,73 Bb
85,73 Aa
CV (%)
6,66
Médias seguidas pela mesma letra maiúscula nas linhas e minúscula nas colunas não diferem entre si, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de significância.
A concentração de TTC a 0,30% se mostrou mais eficiente na estimativa da viabilidade polínica, além de fornecer polens com coloração mais intensa. Tal efeito deve estar ligado a maior quantidade de sais de tertazólio disponíveis para reagir com a desidrogenase, durante a respiração celular. O corante TTC reflete a atividade das enzimas desidrogenase envolvidas na atividade respiratória de tecidos vivos, onde quanto maior a taxa de respiração celular, mais intensa será a coloração adquirida pelo pólen. Alguns autores argumentam que o teste do TTC é uma estimativa confiável da viabilidade polínica, sendo próxima àquela fornecida pelos testes de germinação in vitro. Além disso, o TTC é muito utilizado por ser um método relativamente rápido e simples. (JESUS et al, 2011). A solução de 2,3,5-trifenil-tetrazólio ou TTC é distinta dos outros testes por envolver uma reação enzimática (MUNHOZ et al., 2008). Os sais de cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio confirmam a viabilidade polínica através das enzimas ativas que provocam mudanças na cor dos grãos para o vermelho na presença da atividade oxidativa. A reação do corante indica a presença da atividade enzimática contida nas células vivas (SANTOS et al., 2005). Para essa solução foram considerados viáveis os grãos de pólen que coraram de vermelho e não viáveis os sem coloração ou muito claros. Em relação ao tempo de exposição, para a concentração de 0,30%, o tempo que se mostrou mais eficiente foi o de 12 horas, com 93,86% de viabilidade, e o menor valor foi encontrado no tempo de 24 horas com 45,73% de polens viáveis. Já para a concentração de 0,075% os valores variaram de 71,13% para 6 horas a 85,73% para 24 horas. Quanto menor a concentração maior será o tempo necessário para ocorrer a reação e o pólen adquirir uma coloração mais intensa, devido a isso a concentração de Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 8, n.1, 2016. Número especial 2.
XII CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA – FCAV/UNESP 0,075% necessitou de maior tempo para atingir um maior valor de viabilidade (Tabela 1).
4. Conclusão Independente da concentração e tempo de exposição, o TTC se mostrou eficiente na determinação da viabilidade polínica de Ipomea carnea, sendo a média percentual de viabilidade maior que 70%. A concentração de 0,30% por 12 horas de exposição se mostrou mais eficiente por corar com uma coloração mais intensa e distinguir mais facilmente os polens viáveis dos inviáveis.
Referencias FERREIRA, D. F. Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia(UFLA), V. 35, 2ª Ed., p.1039-1042, 2011. JESUS, O. N.; SOARES, T. L.; OLIVEIRA, E.D.; MARTINS, C.A.D.; SANTOSSEREJO, J.N. Comportamento germinativo e viabilidade polínica de Passifloras oriundos de flores coletadas em diferentes estádios e horários. IN: VI CONGRESSO BRASILEIRO DE MELHORAMENTO DE PLANTAS, V.6, 2011, Búzios-RJ. Anais...Campos dos Goytacazes-RJ: SBMP, p.1-4, 2011. MUNHOZ, M.; LUZ, C.F.P.; FILHO, P. M.; BARTH, O. M.; REINERT, F.Viabilidade polínica de Carica papaya L.: uma comparação metodológica. Revista Brasil. Bot., V.31, n.2, p.209-214, abr.-jun, 2008. SANTOS, M. J.; MACHADO, I. C.; LOPES, A. V. Biologia reprodutiva de duas espécies de Jatropha L. (Euphorbiaceae) na Caatinga, Nordeste do Brasil. Revista Brasil. Bot., V.28, n.2, p.361-373, 2005. SCHWARZ, A; GÓRNIAK, S. L.; BERNARDI, M. M.; DAGLI, M. L. Z.; SPINOSA, H. S. Effects of Ipomoea carnea aqueous fraction intake by dams during pregnancy on the physical and neurobehavioral development of rat offspring. Neurotoxicol. Teratol.,V. 25, p. 615-626, 2003. SHARMA, A.K; SHARMA, A. Chromosome techniques. Switzerland: Harwood Academic Publishers, p.367, 1994. SOUZA, M.M.; PEREIRA, T.N.S.; MARTINS, E.R. Microsporogênese e microgametogênese associadas ao tamanho do botão floral e da antera e viabilidade polínica em maracujá-amarelo (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener). Ciência e Agrotecnologia, V. 26, 2. Ed., Lavras, p.1209-1217, 2002.
Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 8, n.1, 2016. Número especial 2.
